微生物檢測法測定多抗菌素發(fā)酵液生物效價

胡永紅　楊洋　張棋　王濟奎　楊文革

摘要：以多抗菌素生產(chǎn)菌（Streptomyces aureochromogenes NJYHWG66382）為試驗菌株，水稻紋枯菌為指示菌株，用管碟法測量不同濃度多抗菌素標準品抑菌圈大小，多抗菌素標準品在質(zhì)量濃度為200～2 400μg/mL范圍內(nèi)線性擬合度良好，其線性回歸方程為：y=138.23x-2 058.46，r²=0.998 4。確定牛津杯最適裝液量為200μL，精密度相對標準偏差RSD為1.51%，穩(wěn)定性良好。該法能快速檢測多抗菌素效價且靈敏度高，操作簡便，回收率高。

關(guān)鍵詞：多抗菌素；管碟法；精密度；穩(wěn)定性

中圖分類號：S188 文獻標志碼：A 文章編號：1002—1302（2016）01—0306—02

多抗菌素（polyoxins）也被稱為多抗霉素、多效霉素、多氧霉素，能夠抑制真菌細胞壁幾丁質(zhì)的合成，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于治療番茄灰霉病、水稻紋枯病和梨黑斑病等植物真菌病害，是一種抗真菌核苷類抗生素和能夠有效防治植物真菌病害的生物農(nóng)藥。多抗菌素不是一種純凈物，由于其碳鏈上R1、R2、R3 3個位點上官能團的變化，使多抗菌素的組分有多抗菌素A至多抗菌素N 14種之多。由于其成分的復(fù)雜性，導(dǎo)致了高效液相色譜法（HPLC）檢測需要很復(fù)雜的預(yù)處理，同時，考慮到HPLC檢測的成本、周期等因素，因此，用多抗菌素微生物檢測法探索具有重要意義。本研究以多抗菌素生產(chǎn)菌（Streptomyces aureochromogenes NJYHWG66382）為試驗菌株，采用管碟法測量多抗菌素效價，同時進行了精確度、穩(wěn)定性試驗，顯示出了良好的效果。

1材料與方法

1.1試驗菌種

多抗菌素產(chǎn)生菌Streptomyces aureochromogenes NJYH-WG66382，由課題組保藏。水稻紋枯菌：由課題組保藏。多抗菌素標準品是由江蘇豐源生物有限公司提供。

1.4試驗萬法

1.4.1標準溶液配制 精確稱取60 mg多抗菌素標準品置于容量瓶中，用蒸餾水溶解，振蕩，定容至25 mL，得到濃度為2 400μg/mL的標準溶液，置于4℃冰箱備用。

1.4.2發(fā)酵液前處理 取發(fā)酵培養(yǎng)基，倒入50 mL離心管，10 000 r/min，4℃離心15 min，取上清液，用0.45μm微孔濾膜過濾，收集，置于4℃冰箱備用。

1.4.3管碟法檢測多抗菌素含量 取直徑90 mm、高16 mm的平板，向平板中倒入15 mL加熱融化的PDA培養(yǎng)基，使其在碟內(nèi)均勻分布，放置在水平工作臺上，凝固。取直徑約為2 mm的水稻紋枯菌苔，置于平板1/3處，在平板相對位置放置牛津杯[內(nèi)徑（6.0±0.1）mm，外徑（8.0±0.1）mm，高（10.0±0.1）mm]，靜置15 min，使其在培養(yǎng)基上沉降穩(wěn)定后，使用移液槍向牛津杯中添加200μL發(fā)酵液。放置在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，在平板底部墊上1張白紙，用游標卡尺測量抑菌圈直徑，并記錄。

1.4.4線性試驗 將標準品分別稀釋至不同濃度，分別為200、800、1 000、1 600、2 000、2 400μg/mL，使用管碟法（牛津杯法）測定不同濃度多抗菌素標準品的抑菌圈大小（表1），以抑菌圈直徑（mm）為橫坐標，多抗菌素濃度（μg/mL）為縱坐標繪制標準曲線（圖1）。

1.4.5穩(wěn)定性試驗 取“1.4.4”節(jié)中發(fā)酵液6份，分別在0、6、12、18、24 h按“1.4.3”節(jié)方法檢測多抗菌素含量。

1.4.6精密度試驗 準確吸取多抗菌素標準品儲備液，按“1.4.3”節(jié)方法進行檢測，做6組平行試驗。

1.4.7回收率試驗 取已知多抗菌素含量的發(fā)酵液5份，分別加入同等體積、相同濃度的多抗菌素標準品溶液，按“1.4.4”節(jié)方法進行測定，計算回收率。

2結(jié)果與討論

2.1標準曲線

根據(jù)抑菌圈大小繪制標準曲線，從圖1可以看出，多抗菌素濃度在200～2 400μg/mL范圍內(nèi)線性擬合度良好，其回歸方程為：y=138.23x-2 058.46，r²=0.998 4。

2.2牛津杯最佳裝液量

分別通過添加100、150、200、250μL的多抗菌素標準溶液，來觀察抑菌圈大小。當(dāng)牛津杯裝液量為250μL時，由于液體表面張力，在牛津杯上方會形成一個曲面弧度，發(fā)酵液會因為接觸培養(yǎng)皿上蓋而造成損失，影響檢測結(jié)果。隨著裝液量的減少，平板上抑菌圈逐漸變小，因此選擇200μL的裝液量最為合適。

2.3穩(wěn)定性試驗

對發(fā)酵液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性進行抑菌圈觀察分析。結(jié)果（圖2）表明，發(fā)酵液在24 h內(nèi)多抗菌素含量基本穩(wěn)定，未發(fā)生顯著變化。

2.4精密度試驗

選擇2400μg/mL的標準品溶液進行6次平行試驗，分別測量抑菌圈大小，RSD為1.51%（n=6），表明該方法精密度較好（表3）。

2.5回收率試驗

通過回收率試驗，測量混合液形成的抑菌圈直徑，結(jié)果見表4，試樣回收率分別為99.3%～101.4%，其RSD值為1.87%～2.15%，其平均回收率為100.1%，回收率效果較好。

3結(jié)論

本研究建立了管碟法測量發(fā)酵液中多抗菌素含量的方法，使用水稻紋枯菌為指示菌株。多抗菌素標準品在質(zhì)量濃度為200～2 400μg/mL范圍內(nèi)線性擬合度良好，其線性回歸方程為：y=138.23x-2 058.46，r²=0.998 4。并驗證了該法的穩(wěn)定性和精密度，證明回收率較高。由于微生物檢測法操作簡便、成本低，相對于HPLC法對于儀器設(shè)備的要求低，因此，可采用微生物檢測法代替HPLC法檢測發(fā)酵液中多抗菌素的含量。