蓖麻蠶對(duì)辛硫磷農(nóng)藥的代謝抗性機(jī)制

陳立華　張?jiān)氯A　錢荷英　孫平江　李剛　徐安英

摘要：將40%辛硫磷原液稀釋成35～70 mg/L濃度區(qū)間的8個(gè)濃度梯度，采用浸葉法測(cè)定了辛硫磷對(duì)于5齡第3天蓖麻蠶（Philosamia cynthia ricini）24 h的半致死濃度（LCso），計(jì)算出40%辛硫磷乳油對(duì)蓖麻蠶的LC₅₀（24 h）為51.81 mg/L。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qRCR）方法檢測(cè)添食50 mg/L辛硫磷后蓖麻蠶乙酰膽堿酯酶基因Pcracel、Pcrace2在不同組織（血液、脂肪體、中腸、絲腺、頭）中的表達(dá)變化，結(jié)果顯示：在添食辛硫磷之后，Pcracel、Pcrace2在各組織中的表達(dá)都有變化，其中Pcracel在頭部、脂肪體的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量分別比對(duì)照組高10.66、26.50倍；Pcrace2在頭部、脂肪體的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量分別比對(duì)照組高24.73、14.56倍；Pcracel、Pcrace2表達(dá)量在中腸、絲腺中的變化不大，上調(diào)的倍數(shù)分別是7.65、5.62與3.44、2.34倍；Pcracel、Pcrace2在血液中幾乎無(wú)表達(dá)變化，表達(dá)變化倍數(shù)分別為2.52、1.11倍。結(jié)果表明，Pcracel、Pcrace2主要在脂肪體、頭部發(fā)揮代謝解毒作用，而中腸、絲腺等組織對(duì)農(nóng)藥辛硫磷的代謝解毒作用較小，血液幾乎不參與解毒作用。

關(guān)鍵詞：蓖麻蠶；辛硫磷；半致死濃度（LC₅₀）；代謝解毒；乙酰膽堿酯酶基因（ace）

中圖分類號(hào)：S885.22 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002—1302（2016）01—0264—03

蓖麻蠶（Philosamia cynthia ricini）原產(chǎn)于印度，是大蠶蛾科樗蠶的一個(gè)亞種，以蓖麻葉、椿樹(shù)葉及木薯葉為主要飼料，在我國(guó)廣西、江蘇、內(nèi)蒙以及印度、泰國(guó)等東南亞國(guó)家進(jìn)行飼養(yǎng)，是絹絲生產(chǎn)的重要蠶品種之一。辛硫磷是一種以觸殺、胃毒為主的高效低毒有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑，因其具有殺蟲(chóng)廣譜性和無(wú)內(nèi)吸作用，廣泛應(yīng)用于小麥、玉米、水稻、棉花、桑樹(shù)等作物的多種鱗翅目害蟲(chóng)的防治。但是在對(duì)木薯、蓖麻等作物害蟲(chóng)進(jìn)行防治的過(guò)程中，由于對(duì)藥物濃度、殘留期等把握不好，蓖麻蠶農(nóng)藥中毒的情況時(shí)有發(fā)生，導(dǎo)致蠶農(nóng)養(yǎng)蠶絕收或蠶繭質(zhì)量、產(chǎn)量下降，養(yǎng)蠶戶出現(xiàn)較大的經(jīng)濟(jì)損失，成為蓖麻蠶產(chǎn)業(yè)發(fā)展的阻力。

乙酰膽堿酯酶是昆蟲(chóng)靶標(biāo)抗性作用靶標(biāo)之一，為有機(jī)磷、氨基甲酸酯類殺蟲(chóng)劑的作用靶標(biāo)，乙酰膽堿酯酶的突變和超表達(dá)是昆蟲(chóng)抵抗殺蟲(chóng)劑的重要方法，國(guó)內(nèi)外已有許多相關(guān)報(bào)道。王舉梅等對(duì)家蠶添食辛硫磷前后2種乙酰膽堿酯酶基因（ace1、ace2）的轉(zhuǎn)錄特征進(jìn)行了研究，結(jié)果表明：在正常的家蠶中，ace1在各組織中表達(dá)量差異很大，在腦組織中高量表達(dá)，在其他所有組織中只有微弱的表達(dá)；而ace2在各組織中的表達(dá)量差距不大，在中腸、絲腺和血淋巴中相對(duì)表達(dá)量較低，在脂肪體、卵巢中相對(duì)表達(dá)量較高。劉芳等已發(fā)現(xiàn)乙酰膽堿酯酶不敏感的果蠅、家蠅、埃及伊蚊等抗性昆蟲(chóng)。目前關(guān)于蓖麻蠶在靶標(biāo)抗性解毒酶分子水平的研究報(bào)道很少。本研究根據(jù)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》推薦的浸葉法測(cè)定辛硫磷對(duì)蓖麻蠶5齡第3天24 h的半致死濃度（LC₅₀），并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qRCR）方法檢測(cè)添食辛硫磷后乙酰膽堿酯酶基因在不同組織（血液、脂肪體、中腸、絲腺、頭）中的表達(dá)變化，以期為蓖麻蠶抗藥性研究提供基礎(chǔ)，也為害蟲(chóng)的防治提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與藥劑

供試農(nóng)藥：40%辛硫磷乳油，連云港立本農(nóng)藥化工有限公司生產(chǎn)。供試蓖麻蠶品種：海藍(lán)（B7）品種，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所提供，用常規(guī)方法催青，飼養(yǎng)至5齡第3天，選取發(fā)育一致的正常蓖麻蠶幼蟲(chóng)個(gè)體。供試蓖麻葉：由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所試驗(yàn)場(chǎng)提供，采摘未施用農(nóng)藥的新鮮5齡蓖麻葉。

1.2菌種與試劑

大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，由筆者所在課題組制備。PrimeScrip RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）、SYBR Premix Ex Taq^TMⅡ（Tli RNaseH plus）、pMD19-T Simple Vector等，購(gòu)自大連寶生物工程公司。TRIzol試劑，購(gòu)自Promega公司。

1.3辛硫磷對(duì)蓖麻蠶LC₅₀的測(cè)定

采用浸葉法測(cè)定辛硫磷對(duì)蓖麻蠶5齡第3天24 h的LC₅₀。參照農(nóng)藥公司推薦的使用濃度和預(yù)試驗(yàn)測(cè)定的24 h蓖麻蠶全部死亡和全部存活的濃度，正式試驗(yàn)在此濃度范圍內(nèi)重新設(shè)定濃度，以蒸餾水浸泡蓖麻葉為對(duì)照。將40%辛硫磷原液分別稀釋成35、40、45、50、55、60、65、70 mg/L，共8個(gè)濃度梯度。將蓖麻葉切成1 cm²左右的方片，在辛硫磷配制液中浸泡10 s，自然晾干后供蓖麻蠶食用。采用添食毒蓖麻葉1g/頭的標(biāo)準(zhǔn)，取飼養(yǎng)20頭5齡第3天蓖麻蠶為1個(gè)試驗(yàn)組，每個(gè)濃度3次重復(fù)，共計(jì)60頭。將喂食添加辛硫磷農(nóng)藥后的蓖麻蠶置于溫度為25℃、相對(duì)濕度80%的環(huán)境中飼養(yǎng)，24 h后觀察并記錄中毒情況及死亡數(shù)。

采用Abbott公式計(jì)算添食辛硫磷后蓖麻蠶的死亡率，當(dāng)對(duì)照組死亡率為0時(shí)，試驗(yàn)組死亡率=[（試驗(yàn)蠶數(shù)-藥后活蠶數(shù)）/試驗(yàn)蠶數(shù)]×100%；當(dāng)對(duì)照組死亡數(shù)<10%時(shí)，試驗(yàn)組死亡率=[（試驗(yàn)組死亡率-對(duì)照組死亡率）/（1-對(duì)照組死亡率）]×100%。在Excel中計(jì)算出辛硫磷對(duì)蓖麻蠶的毒力回歸方程和半致死濃度。

1.4蓖麻蠶乙酰膽堿酯酶基因的克隆