2，3，7，8—四氯二苯并—p—二惡英對建鯉肝組織損傷作用研究

杜金梁　曹麗萍　賈睿　劉英娟　趙才源　申玉金　丁煒東　殷國俊

摘要：利用精密肝切片培養(yǎng)技術(shù)研究2，3，7，8-四氯二苯并-p-二惡英（TCDD）對建鯉肝組織的損傷作用，將精密肝切片組織分為5個(gè)處理組，每個(gè)處理組4個(gè)重復(fù)，將不同濃度TCDD（濃度設(shè)定為0.00、0.05、0.10、0.30、0.60μg/L）處理肝切片3 h后，收集上清培養(yǎng)液及肝切片組織測定丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（GPT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（GOT）、乳酸脫氫酶（LDH）、超氧化物歧化酶（sOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、丙二醛（MDA）、三磷酸腺苷（ATP）等生化指標(biāo)含量變化。結(jié)果表明：TCDD濃度在0.30μg/L時(shí)，對精密肝切片組織損傷較大，可以顯著提高上清培養(yǎng)液中GPT、GOT、MDA的含量，顯著提高切片勻漿上清液中LDH的活性值，與空白對照組相比，差異極顯著（P<0.01）；可以顯著降低切片勻漿上清液中ATP、GSH-PX的含量，與空白對照組相比，差異極顯著（P<0.01）；顯著降低上清培養(yǎng)液中SOD活性值，與空白對照組相比，差異顯著（P<0.05）。這說明采用TCDD進(jìn)行急性染毒后，可以造成建鯉肝組織的損傷，使機(jī)體組織處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，產(chǎn)生一系列氧化應(yīng)激反應(yīng)。

關(guān)鍵詞：2，3，7，8-四氯二苯-p-二惡英（TCDD）；精密肝切片；建鯉；毒性機(jī)理

中圖分類號：S941.8 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1002—1302（2016）01—0248—03

二惡英為三環(huán)芳香族化合物，是一類多種化合物的統(tǒng)稱，能夠持續(xù)危害自然界環(huán)境和生物體。而2，3，7，8-四氯二苯-p-二惡英（TCDD）是其中毒性最強(qiáng)的一類物質(zhì)，目前關(guān)于TCDD的研究主要涉及自然界環(huán)境以及哺乳動(dòng)物方面，涉及到魚類的研究相對較少。在水產(chǎn)方面報(bào)道主要有黃金華等對2，3，7，8-四氯二苯并-p-二惡英（TCDD）對魚類功能基因表達(dá)的研究，許友卿等對2，3，7，8-四氯二苯并-p-二惡英對魚類生長的影響，關(guān)于TCDD對魚類肝組織受TC-DD損傷的研究鮮有報(bào)道。魚類對水體污染較敏感，魚組織吸收了污染物TCDD后會(huì)影響其許多生理和生化作用，且TCDD進(jìn)入機(jī)體后首先是在肝臟進(jìn)行解毒和生物轉(zhuǎn)化，機(jī)體肝臟是一個(gè)重要的解毒器官。由于TCDD的毒性強(qiáng)、危害大，關(guān)于其毒性機(jī)理尚未弄清，難以防治，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來較大的負(fù)面影響。因此，一方面應(yīng)該積極防止和減少TCDD的產(chǎn)生和污染，另一方面努力深入研究TCDD的毒性及其機(jī)制，為防治TCDD毒害提供技術(shù)依據(jù)。

目前，有很多毒物可以引起機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)，但TCDD是否會(huì)引起魚類肝組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)尚不清楚，因此本研究以建鯉為試驗(yàn)材料，利用不同濃度TCDD處理建鯉肝組織切片，來研究TCDD對魚類肝組織的毒害作用，為以后研究TCDD對魚類毒害機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1試驗(yàn)魚 試驗(yàn)用建鯉取自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心漁場，體質(zhì)健康、無傷，取回后將建鯉于循環(huán)水系統(tǒng)中暫養(yǎng)1周。

1.1.2試劑和儀器 L15培養(yǎng)基、HBSS（Hanks，balanced sault solution）溶液、慶大霉素和兩性霉素B（購自美國SIGMA公司）；新生小牛血清（FCS）（浙江天杭生物科技有限公司）和細(xì)胞培養(yǎng)板（GIBCO公司）；2，3，7，8-四氯二苯-p-二惡英（廈門慧嘉生物科技有限公司）；GPT、GOT、LDH、GSH-PX、ATP、MDA和SOD測定試劑盒（南京建成生物工程研究所科技有限公司）；MS一222麻醉劑（購自美國SIGMA公司）；723分光光度計(jì)（上海欣茂儀器有限公司）；酶標(biāo)儀MK3（美國Thermo公司），KD-400切片機(jī)（購自浙江金華科迪儀器有限公司）。

1.2方法

1.2.1建鯉精密肝切片的制備 選取健康無病體質(zhì)量在800～1 500 g的建鯉來進(jìn)行試驗(yàn)，采用MS-222麻醉。無菌采取肝臟后放人冷的L15培養(yǎng)基中（50μg/ml慶大霉素和2.5 mg/mL兩性霉素B），修整肝組織塊，選取5 mm×5 mm的肝組織塊來進(jìn)行切片，切片厚度為300μm，選取完整切片置于24孔培養(yǎng)板中，每組4孔，每孔6片，置于27℃、5%體積分?jǐn)?shù)CO₂條件下培養(yǎng)備用。

1.2.2 TCDD誘導(dǎo)精密肝切片損傷模型制備 將獲得的精密肝切片預(yù)培養(yǎng)30 min后，棄掉培養(yǎng)液換用含不同濃度（0.00、0.05、0.10、0.30、0.60μg/L）的TCDD進(jìn)行處理，繼續(xù)培養(yǎng)3 h。然后收集上清培養(yǎng)液以及肝切片進(jìn)行GOT、GPT、LDH、GSH-PX、MDA、SOD等指標(biāo)測定。

1.2.3 ATP含量的測定 收集不同濃度（0.00、0.05、0.10、0.30、0.60μg/L）TCDD處理的精密肝組織切片來進(jìn)行ATP含量的測定，具體操作方法參照試劑盒說明書。

1.2.4建鯉精密肝切片上清培養(yǎng)液中SOD、GPT、MDA、GOT的測定 將收集精密肝切片上清培養(yǎng)液按照南京建成生物工程研究所試劑盒說明書操作方法進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)測定。

1.2.5精密肝組織切片勻漿上清液中LDH和GSH-PX含量的測定 收集肝組織切片進(jìn)行勻漿液制備，按照切片質(zhì)量與生理鹽水1：9比例制備成10%的組織勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清液用于LDH和GSH-PX的測定。

1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均用SPSS 16.0軟件進(jìn)行處理。采用One-Way ANOVA檢驗(yàn)法進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，對樣本間進(jìn)行t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2結(jié)果與分析

2.1 TCDD對精密肝組織切片活力的影響

由圖1可知，加入不同濃度的TCDD后，ATP含量呈下降趨勢，且隨著藥物濃度的不斷加大，其含量下降越明顯，TCDD濃度在0.30、0.60μg/L時(shí)，與空白對照組相比差異極顯著（P<0.01）。

2.2 TCDD對精密肝切片培養(yǎng)液中GPT、GOT活性的影響

由圖2-A可知，切片經(jīng)過TCDD處理，GPT活性值明顯升高，其濃度在0.10、0.60μg/L時(shí)，GPT活性值與空白對照組相比顯著升高（P<0.05）；TCDD濃度在0.30μg/L，GPT活性值與空白對照組相比極顯著升高（P<0.01）。由圖2-B可知，在TCDD濃度達(dá)到0.30μg/L時(shí)，GOT活性值與空白對照組相比極顯著升高（P<0.01）。

2.3 TCDD對精密肝切片勻漿上清液中LDH活性的影響

由圖3可知，LDH活性值有隨著藥物濃度增加而升高趨勢，TCDD濃度在0.10μg/L時(shí)，LDH活性值與空白對照組相比顯著升高（P<0.05）；TCDD濃度達(dá)到0.30μg/L時(shí)，LDH活性值與空白對照組相比極顯著升高（P<0.01）。

2.4 TCDD對精密肝切片培養(yǎng)液中SOD、MDA含量的影響

由圖4可知，TCDD處理后的SOD活性值呈降低趨勢，當(dāng)濃度在0.30μg/L時(shí)，SOD活性值與空白對照組相比顯著降低（P<0.05）；當(dāng)濃度在O.60μg/L時(shí)，SOD活性值與空白對照組相比極顯著降低（P<0.01）。TCDD處理后的MDA含量呈升高趨勢，有隨著濃度加大其含量不斷增加趨勢，TCDD濃度在0.10、0.30μg/L，MDA含量與空白對照組相比極顯著增加（P<0.01）。

2.5 TCDD對精密肝切片勻漿上清液中GSH-PX含量的影響

由圖5可知，經(jīng)過TCDD處理后，隨著TCDD濃度的加大，其活性值在不斷下降，在TCDD濃度為0.30、0.60μg/L時(shí)，GSH-PX含量與空白對照組相比極顯著降低（P<0.01）。

3討論

精密肝切片培養(yǎng)技術(shù)是一種介于器官和細(xì)胞之間的試驗(yàn)手段，由于具有制片相對簡單、能保證組織完整性等特點(diǎn)，此項(xiàng)技術(shù)被國內(nèi)外廣泛應(yīng)用于藥物篩選過程中，但精密肝切片技術(shù)也有它自身的缺點(diǎn)，不如肝細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間長。對水產(chǎn)動(dòng)物而言，國內(nèi)外沒有應(yīng)用魚類肝精密組織切片技術(shù)來研究TCDD損傷機(jī)制的報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)室成功研制了魚類精密肝切片培養(yǎng)技術(shù)，為以后了解藥物對魚類肝組織損傷研究提供了一種新的技術(shù)手段。

有相關(guān)報(bào)道稱TCDD可以促使機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，如使脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量增加，抗氧化酶指標(biāo)SOD、GSH-PX等活力下降。經(jīng)過TCDD處理后所產(chǎn)生的一系列氧化應(yīng)激反應(yīng)具體作用機(jī)制是由于TCDD與機(jī)體內(nèi)的芳香烴受體AHR結(jié)合后，改變了一些酶的活性和蛋白質(zhì)。正常情況下，氧自由基在機(jī)體內(nèi)是不斷產(chǎn)生并不斷清除的，當(dāng)遇到毒物刺激時(shí)，機(jī)體就會(huì)產(chǎn)生氧自由基，如果產(chǎn)生氧自由基過多，機(jī)體來不及進(jìn)行自身代謝來消除，就會(huì)引起機(jī)體的抗氧化體系失去平衡，進(jìn)而引起機(jī)體組織損傷。GOT、GPT是判定肝組織健康狀態(tài)的經(jīng)典指標(biāo)，被廣泛應(yīng)用到肝損傷模型的構(gòu)建當(dāng)中，如在本試驗(yàn)中，加入不同濃度的TCDD后發(fā)現(xiàn)，肝切片上清培養(yǎng)液中GOT、GPT活性值明顯升高，這說明TCDD可以引起肝切片組織的損傷，使GOT、GPT這2個(gè)酶學(xué)指標(biāo)不斷從機(jī)體中釋放出來，加重了肝組織的損傷，TCDD濃度在0.30μg/L時(shí)其活性值達(dá)到一個(gè)高點(diǎn)，與空白對照組相比，差異顯著（P<0.01）。當(dāng)TCDD濃度達(dá)到0.60μg/L時(shí)其活性值出現(xiàn)下降的趨勢。LDH存在于機(jī)體細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，如果機(jī)體受到損傷，其含量也會(huì)發(fā)生一定的變化，在本試驗(yàn)中TCDD濃度在0.10、0.30μg/L時(shí)，其活性值明顯增加，這說明切片肝組織受到了TCDD的攻擊，因而造成其數(shù)值發(fā)生變化。本試驗(yàn)結(jié)果與前人結(jié)果類似。

ATP是機(jī)體內(nèi)重要的能量分子，它在機(jī)體生理和病理過程中發(fā)揮著重要作用，當(dāng)機(jī)體處于病理或毒物刺激時(shí)，其含量就會(huì)下降，依此來判斷機(jī)體的健康水平。在本試驗(yàn)中主要應(yīng)用于判定切片的活性水平，當(dāng)用不同濃度TCDD處理切片組織后發(fā)現(xiàn)，ATP含量隨著藥物濃度不斷加大而逐漸降低，TCDD濃度在0.3、0.6μg/L時(shí)，其含量值最低，與空白對照組相比，差異極顯著（P<0.01），這說明隨著藥物濃度的加大，肝切片活力下降。

當(dāng)機(jī)體受到自由基攻擊后就會(huì)出現(xiàn)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，MDA就是其中一個(gè)判定指標(biāo)，其含量高低反映了機(jī)體受損傷程度，可以準(zhǔn)確反映脂質(zhì)過氧化程度。而SOD、GSH-PX這2個(gè)指標(biāo)屬于抗氧化酶體系，其含量變化反映的是機(jī)體抗氧化能力的高低。在本試驗(yàn)中，經(jīng)過TCDD處理后，SOD、GSH-PX活性值隨著藥物濃度的增加呈逐漸降低趨勢，TCDD濃度達(dá)到0.30μg/L時(shí)，SOD、GSH-PX活性值明顯下降，與空白對照組相比，差異顯著或者極顯著（P<0.05或P<0.01）；TCDD濃度達(dá)到0.60μg/L時(shí)，SOD、GSH-PX活性值明顯下降，與空白對照組相比，差異極顯著（P<0.01）。而MDA含量隨著藥物濃度增加不斷增加，這說明建鯉肝組織損傷程度在不斷加大。通過以上指標(biāo)的測定說明TCDD使精密肝切片組織處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，造成機(jī)體的損傷。

綜上所述，TCDD可以造成魚類肝組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)，且在濃度為0.30μg/L時(shí)，精密肝切片組織的損傷較為嚴(yán)重，關(guān)于其具體毒性機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。