桿菌肽與牛血清白蛋白相互作用的熒光光譜

張玉明　倪志華

摘要：利用熒光光譜法研究桿菌肽與牛血清白蛋白的相互作用，結果表明，桿菌肽可使牛血清白蛋白的內源熒光發生猝滅。在不同溫度下研究桿菌肽對牛血清白蛋白的熒光猝滅作用，利用Stern-Volmer方程處理試驗數據，證明熒光猝滅機理屬于靜態猝滅。桿菌肽與牛血清白蛋白具有1個結合位點，計算得到不同溫度下桿菌肽與牛血清白蛋白的結合常數（K_A）為3.38×10⁴L/mol（298 K）、2.92×10⁴L/mol（308 K）、1.56×10⁴L/mol（318K）。通過計算熱力學參數可知，桿菌肽與牛血清白蛋白的相互作用是吉布斯自由能降低的自發過程，且二者間的主要作用力類型為靜電作用。三維熒光光譜試驗顯示，桿菌肽的加入引起牛血清白蛋白構象的變化，表現為蛋白質內部色氨酸殘基所處微環境的疏水性降低。

關鍵詞：桿菌肽；牛血清白蛋白；相互作用；熒光光譜；猝滅；熱力學參數

中圖分類號：Q631 文獻標志碼：A 文章編號：1002—1302（2016）01—0245—03

桿菌肽是一種藥用飼料添加劑，在畜牧養殖業應用廣泛，具有促進動物生長、抑制腸道中有害微生物生長、提高機體免疫力的作用，被譽為綠色抗生素飼料添加劑。牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）是血漿中含量最豐富的蛋白質之一，在血液中主要具有維持滲透壓、緩沖pH值等作用。BSA可與多種陽離子、陰離子、其他小分子物質結合，具有儲運內源性代謝產物、外源性藥物的重要生理功能；因此，BSA與藥物分子的相互作用研究已受到重視。桿菌肽被攝入機體后，極有可能與血液中的BSA結合，以復合物形式在體內吸收、轉運。研究桿菌肽與BSA之間的相互作用，有助于了解藥物在體內的運輸分布和代謝，對于闡明桿菌肽的藥理作用和藥代動力學具有重要意義。熒光光譜法是研究蛋白質等生物大分子與各種小分子相互作用的重要手段。應用熒光光譜法研究桿菌肽與BSA問的相互作用，著重闡述桿菌肽與BSA的熒光猝滅機理、結合常數、熱力學常數，并使用三維熒光技術研究桿菌肽對BSA高級結構的影響。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

F97pro型熒光分光光度計（上海棱光技術有限公司），BSll0S型精密電子分析天平（德國sartorius公司），HH系列數控恒溫水浴鍋（金壇市科析儀器有限公司），明澈-D型超純水機（Millipore公司）。桿菌肽（上海金穗生物科技有限公司），牛血清白蛋白（北京索萊寶科技有限公司），其他試劑均為分析純。以0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH值7.4）為溶劑，配制0.1 mmol/L的BSA標準溶液。桿菌肽使用超純水配成1.0 mmol/L的標準溶液。

1.2方法

準確移取一定量的桿菌肽標準溶液于10 mL具塞玻璃試管中，加入BSA標準溶液1.0 mL，于一定溫度下恒溫放置1 h。在激發和發射光柵狹縫均為5 nm、激發波長為280 nm時，掃描270～500 nm波長范圍內BSA、BSA-桿菌肽的熒光光譜。在激發波長270～400 nm、發射波長270～400 nm范圍內進行三維熒光掃描，比較溶菌酶與桿菌肽一溶菌酶體系的熒光等高線。

2結果與分析

2.1熒光猝滅光譜

BSA分子因含有色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等氨基酸殘基而發射內源熒光，其中色氨酸的熒光強度最大。激發光為280 nm時，可認為蛋白質所呈現的熒光源自分子中的色氨酸。熒光猝滅指任何降低某樣品熒光強度的過程，分子間的相互作用可導致熒光猝滅。

由圖1可知，BSA溶液在波長280 nm光激發下可在333.4 nm處具有最大熒光發射峰。在BSA濃度保持恒定的情況下，BSA的內源性熒光強度隨桿菌肽濃度的增加而有規律地降低，表明桿菌肽對BSA的內源熒光發生了猝滅作用。隨著桿菌肽的加入，BSA的最大熒光發射峰出現紅移。桿菌肽濃度為50 nmol/L時，BSA溶液體系的最大熒光發射峰由333.4 nm變化為357.8 nm，即紅移了24.4 nm。一般認為，蛋白質中色氨酸殘基的最大發射峰與其所處環境的極性密切相關，由發射波長的改變可判斷蛋白質構象的變化。上述現象表明桿菌肽的加入使BSA構象發生了變化，色氨酸殘基所處環境疏水性降低，桿菌肽與BSA分子發生了相互作用。

2.2桿菌肽對BSA的熒光猝滅機理

有機小分子對蛋白質的熒光猝滅作用主要分為動態猝滅和靜態猝滅。動態猝滅主要是一種能量轉移或電子轉移過程，不影響蛋白質的結構和生理活性；靜態猝滅主要是由于小分子和蛋白質等生物大分子發生了相互作用，可能生成不發熒光的配合物。一般認為，動態猝滅是熒光體與猝滅劑之間因相互碰撞而使熒光被猝滅的過程，溫度升高可增加分子碰撞的機會，從而提高猝滅效率；靜態猝滅是熒光體與猝滅劑之間形成了基態配合物，溫度升高使配合物的穩定度下降，從而減小靜態猝滅的程度。動態猝滅和靜態猝滅均符合Stem-Volmer關系式：

以峰的位置來看，加入桿菌肽后BSA的瑞利散射峰起始位置、熒光峰位置均無顯著變化。以峰的強度來看，圖3-b中“鉛筆”“指紋”形紋線變得稀疏，“指紋”形紋線的變化趨勢尤為明顯。可見，加入桿菌肽后瑞利散射峰和熒光峰的相對強度均有不同程度的降低。

BSA的空間結構由3個結構域組成，每個結構域由2個亞結構域以槽口相對的方式形成圓筒狀結構，幾乎所有疏水性氨基酸殘基均包埋在圓筒內部而構成疏水腔。桿菌肽分子與BSA的結合部位可能均處于這種疏水腔中，由于桿菌肽與BSA發生反應生成一種新復合物，從而導致疏水微環境極性的改變，進而引起BSA構象的變化。三位熒光光譜結果驗證了本試驗結論，即桿菌肽與BSA發生了相互作用，熒光猝滅機制屬于靜態猝滅。

3結論

利用熒光光譜法研究了桿菌肽與BSA的相互作用，桿菌肽對BSA的內源熒光具有較強的猝滅作用，原因是桿菌肽與BSA分子結合形成復合物。分別測定不同溫度下桿菌肽與BSA的結合常數、結合位點、熱力學參數，結果表明桿菌肽對BSA的熒光猝滅機制為靜態猝滅，二者的結合主要基于靜電作用，約形成1個結合位點。三維熒光光譜研究表明，桿菌肽與BSA的結合導致了蛋白質分子內部疏水微環境極性的改變，進而導致BSA構象的變化。