山羊傳染性胸膜肺炎自家苗的制備與臨床應用

胡新崗　黃銀云　郭廣富　田亞軍　朱止南　許余良

摘要：為臨床防控山羊傳染性胸膜肺炎，采用常規方法制備山羊傳染性胸膜肺炎組織滅活苗，通過自制苗與市售山羊傳染性胸膜肺炎氫氧化鋁滅活菌苗進行免疫比較試驗，并采用正向間接血凝試驗（IHA）方法監測試驗羊抗體水平，試驗后開展臨床實踐。結果表明，自家苗用于羊場山羊傳染性胸膜肺炎的緊急免疫接種是可行的。

關鍵詞：山羊傳染性胸膜肺炎；自家苗；制備；臨床應用；效果

中圖分類號：S851.35；S858.27 文獻標志碼：A 文章編號：1002—1302（2016）01—0236—03

山羊傳染性胸膜肺炎（contagious caprine pleuropneumonia，CCPP）俗稱爛肺病，是由山羊支原體山羊肺炎亞種（Mccp）、絲狀支原體山羊亞種（Mmc）、綿羊肺炎支原體（Movi）等多種致病支原體引起的山羊呼吸道傳染病，被世界動物衛生組織（OIE）確定為法定報告的山羊傳染病之一。該病呈急性或慢性高度接觸性傳染，主要癥狀是發熱、咳嗽、氣喘，病變以纖維素性肺炎和胸外膜炎為特征。由于病原支原體的多樣性以及支原體的分離培養與鑒定比較困難，僅靠癥狀及病變在臨床上難以確診，致使基層獸醫人員臨床用藥針對性不強，誤診誤治現象普遍，導致該病在我國長期存在。作為世界上養羊數量最多的國家和最大的羊肉出口國，山羊傳染性胸膜肺炎對我國山羊養殖業造成了非常大的危害。目前，山羊傳染性胸膜肺炎的免疫預防主要靠接種山羊傳染性胸膜肺炎氫氧化鋁滅活菌苗，但它是用絲狀支原體山羊亞種C87-1株制備，由于臨床上多種支原體性病原的存在，該疫苗預防山羊傳染性胸膜肺炎的效果還不大理想。因此，加強山羊傳染性胸膜肺炎的防控研究、減少該病對地方養羊業的侵擾，對于促進養羊場（戶）的增效增收具有重要意義。為了解決泰州地區山羊傳染性胸膜肺炎的防控難題，江蘇農牧科技職業學院羊病研究課題組聯合行業企業，開展用自家苗防治山羊傳染病胸膜肺炎的研究，通過血清學方法測定其抗體效價，并與國產疫苗預防效果相比較，以期為科學防控山羊傳染病胸膜肺炎提供新的途徑。

1材料與方法

1.1主要儀器與設備

主要儀器與設備有：無菌操作臺、潔凈組織搗碎機、勻漿機、37℃恒溫培養箱、低溫冰箱、微生物學試驗常規儀器等。

1.2試驗試劑

山羊傳染性胸膜肺炎氫氧化鋁滅活菌苗（以下簡稱商品苗，哈藥集團生物疫苗有限公司生產），皮下或肌內注射（6個月以下的山羊3 mL/只，6個月以上的山羊5 mL/只）；中國農業科學院蘭州獸醫研究所研制的山羊支原體山羊肺炎亞種MCCP正向間接血凝診斷試劑盒、絲狀支原體山羊亞種MMC正向間接血凝診斷試劑盒、綿羊肺炎支原體MO正向間接血凝診斷試劑盒；普通瓊脂培養基；甲醛溶液；雙抗（青霉素、鏈霉素）等。

1.3病料

從江蘇省泰興市未免疫山羊傳染性胸膜肺炎的A羊場選擇病程較長或瀕臨死亡的臨床癥狀典型的病羊，由頸靜脈采血并分離血清，經山羊支原體正向間接血凝診斷[被檢血清抗體滴度≥1：8（++）判為陽性、血清抗體滴度≤1：4（++）判為陰性]確診后，撲殺患羊，無菌采集病羊肺臟典型肝變組織、縱隔淋巴結，無菌穿刺采取胸腔液。將采集的病料迅速置于0～4℃保存備用，同時取血液、胸腔液接種至普通瓊脂培養基上，其間應無雜菌生長。

1.4自家苗的制備

將采集的病變肺臟、淋巴結組織研磨，經組織搗碎機碎化后與胸腔液混合，按1：4的比例加入滅菌生理鹽水進行稀釋調兌，經1次雙層、2次4層無菌醫用紗布過濾后，加甲醛至其濃度為0.1%，經1 h搖勻后放人37℃恒溫培養箱中滅活，滅活時間48 h，其間每8 h搖動1次，每次30 min。分裝前加入雙抗（青霉素1 000 IU/mL、鏈霉素500 IU/mL）；分裝后封口，置于2～8℃冷暗處存放。安全性檢驗：選用約1.5～2.0kg健康家兔和400 g左右豚鼠各2只，每只肌肉注射2 mL自家苗，10 d內均健活；挑選健康易感山羊2只，各于頸側皮下注射5 mL，觀察7 d無不良反應；普通培養基培養24 h無雜菌生長。

1.5試驗羊只及分組

從A羊場隨機選取90只臨檢未發病、2月齡、體質量相近的雜交波爾山羊，隨機分成商品苗組、自家苗組、空白對照組，每組30只，登記耳標號，分欄統一飼養。接種分首免、二免（加強免疫），二免在首免后21 d進行。商品苗組每只每次皮下接種3 mL商品苗；自家苗組每只每次皮下接種3 mL自家苗；空白對照組每只每次注射3 mL生理鹽水。

1.6待測血清的制備

分別于首免前3 d，首免后14 d，二免后10、30、60、90、120 d空腹頸靜脈采血3～5 mL，常溫析出血清，按組別耳標號編號，-20℃保存備測。

1.7試驗羊只的觀察記錄

試驗開始后每天專人觀察各組羊只的采食、表現、生長及發病情況，并予以詳細記錄，以判斷不同疫苗對山羊傳染性胸膜肺炎的預防效果。

1.8抗體的檢測與統計分析

采用正向間接血凝試驗（IHA）方法對采集的血清樣品進行山羊傳染性胸膜肺炎抗體檢測，按編號逐只記錄血清抗體的IHA效價，差異顯著性按統計學方法進行比較。

1.9自家苗的臨床應用

選擇泰興、高港、姜堰、海陵及開發區的5家發病的養羊場（戶），初診后通過正向間接血凝試驗予以確診，按本試驗方法制備各場（戶）自家苗，進行本場的緊急免疫接種，統計預防有效率。

2結果與分析

2.1抗體陽性率及對羊增質量的影響

所有試驗羊在首免前測定表明，山羊傳染性胸膜肺炎抗體均為陰性。通過表1對免疫前后3組試驗羊IHA抗體陽性數、陽性率的比較可以看出：商品苗組、自家苗組在首免后14 d抗體陽性率均處于較低水平，差異不明顯；二免后10 d，2組的抗體陽性率均大幅提高；二免后30 d，2組抗體陽性率持平；直到二免后60 d，2組抗體陽性率均上升為100%；二免后90～120 d，商品苗組陽性率持續下降，自家苗組則至120 d時才出現下降，但在二免后90 d時即高于商品苗組，說明自家苗組的抗體衰退速度慢于商品苗組。由表1還可以看出，2組羊群抗體的產生都是持續的，而二免能使羊產生較高水平且持續穩定的保護抗體；空白對照組在整個監測過程均未出現山羊傳染性胸膜肺炎抗體陽性羊，說明無論是商品苗組還是自家苗組的免疫，對于預防山羊傳染性胸膜肺炎均是有積極意義的。

從表2可以看出，與對照組相比，接種商品苗羊只的生長差異不顯著，說明接種疫苗不會阻礙動物的生長；而接種自家苗羊的生長在二免后120 d與對照組相比差異顯著（P<0.05），但是否足以說明自家苗能夠促進羊只的生長還有待進一步研究。

2.2試驗羊的IHA抗體水平

從表3免疫前后3組試驗羊IHA抗體水平的比較及表4免疫前后3組試驗羊IHA抗體平均效價的比較可知，商品苗組、自家苗組在首免后14 d抗體水平均較低，低于2log₂/只，起不到預防作用。二免后10 d，2組的抗體水平明顯上升，商品苗組、自家苗組的平均抗體效價分別達到5.83、5.74 log₂/只，免疫合格率均達到了77%。二免后30 d，2組的抗體水平呈快速持續上升趨勢。二免后60 d，2組的抗體水平分別為8.68、8.74 log₂/只，均達到頂峰，自家苗組略高于商品苗組，但差異不顯著，此時商品苗組67%的羊只抗體血凝效價≥1：256，同期自家苗組則有73%的羊只抗體血凝效價≥1：256，并且將高水平的保護抗體維持到二免后90 d，而商品苗組在二免后90 d能夠維持同樣抗體水平的羊只則降至60%。在免疫合格率方面，自二免后60 d，2組免疫合格率均呈下降趨勢，商品苗組下降幅度明顯快于自家苗組，表明自家苗組產生抗體的穩定性、持久性優于商品苗組。二免后120 d，商品苗組、自家苗組的IHA抗體平均效價分別為7.42、8.13 log₂/只，差異明顯，表明本試驗的自家苗免疫原性優于商品苗。

2.3自家苗臨床緊急免疫接種效果

從表5可以看出，參與試驗的5家羊場（戶）采用自家苗二免后，免疫合格率均超過了80%，達到了理論上的免疫密度要求，能夠起到避免群體性發病的作用。二免后山羊傳染性胸膜肺炎的臨床發病率均低于10%，大大低于該病的非免疫易感羊群80%以上的發病率，說明羊只體內的抗體起到了良好的保護作用；而病死率在0～50%，符合該病的臨床特點。統計5家羊場試驗羊只的平均日增質量顯示，均處于0.25～0.30 kg/（d·只）之間，符合肉山羊常規飼養的增質量幅度，說明接種自家苗對山羊的日常生長不會造成不利影響。

3討論

山羊傳染性胸膜肺炎在我國各地廣泛流行，該病的病原支原體呈現多樣性，各地分離到的病原有單一性也有混合性，這種病原的復雜性以及支原體分離培養難的特點，長期以來給山羊傳染性胸膜肺炎的臨床診斷與實驗室確診造成了很大困難，困擾著基層獸醫工作者甚至是一些專業技術人員，導致較多的臨床誤診、誤治、延誤治療時機等狀況，由此疫病造成的養羊業經濟損失十分嚴重。因此，尋找針對性強、簡便可行的防治方法是很有必要的。

長期以來，由支原體引起的動物呼吸道傳染病的預防主要還是靠疫苗免疫。田間試驗證實，用山羊傳染性胸膜肺炎滅活苗免疫，能有效提升羊體內特異性抗體水平、增強機體的特異性抵抗力、減少或避免發病。試驗表明，自家苗免疫過的羊群，在免疫效果上要優于普通商品苗，作為緊急免疫接種可以嘗試采用。這可能是因為自家苗中包含了發病山羊體內的多種抗原成分，對羊群緊急免疫接種后可以對羊體進行全面的誘導，使不同羊只產生不同程度的免疫反應，從而達到預防和抗病的目的，而這一點正好可以彌補山羊傳染性胸膜肺炎商品苗菌株單一的不足。本試驗證實，加強免疫能夠促進動物機體產生高水平抗體，說明對于滅活苗而言，加強免疫十分必要；同時，直到二免后60 d抗體水平達到高峰，說明抗體的產生有一定持續的過程。

養殖生產中如果有適宜的商品苗選用，不建議采用自家苗，更不允許本場制備的自家苗在他場應用。一方面，自家苗的制備需要嚴格的滅活和一定的技術要求，質量不過關有可能導致散毒，過濾不徹底的組織碎質也可能對動物形成較大應激；另一方面，在自家苗的制備過程中，無法準確檢測抗原的含量，抗原過多或過少都有可能導致羊只免疫耐受。作為救急措施采用時，必須請專業人員幫助制備和應用，同時要配合藥物防治、消毒驅蟲、加強營養等綜合措施，才能真正達到疫病防控的目的。