高大環(huán)柄菇菌株的鑒定及生物學(xué)特性

潘雪嬌　曲曉華　劉宇　王守現(xiàn)

摘要：以1株大環(huán)柄菇屬野生菌為研究對(duì)象，依據(jù)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特征鑒定為高大環(huán)柄菇。通過(guò)測(cè)定菌絲生長(zhǎng)速度、菌絲體干質(zhì)量和生長(zhǎng)勢(shì)等指標(biāo)，研究其生物學(xué)特性。結(jié)果表明，該菌菌絲生長(zhǎng)的最適碳源為淀粉，最適氮源為大豆蛋白胨；菌絲生長(zhǎng)適宜的碳氮比為（10～30）：1，最適碳氮比為20：1；最適生長(zhǎng)因子為維生素B₁；菌絲生長(zhǎng)適宜溫度為24～28℃，最適溫度為28℃；最適pH值為7.0。

關(guān)鍵詞：高大環(huán)柄菇；鑒定；組織分離；碳氮比；生長(zhǎng)因子；生物學(xué)特性

中圖分類號(hào)：S646.01 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002—1302（2016）01—0199—03

高大環(huán)柄菇（Macrolepiota procera）別稱高腳環(huán)柄菇、高柄環(huán)菇、棉花菇等，國(guó)外別稱陽(yáng)傘蘑菇，在分類上屬于真菌門擔(dān)子菌亞門層菌綱傘菌目蘑菇科大環(huán)柄菇屬。夏秋季節(jié)于林中地上或草地上單生至散生、稀群生一起，是主要分布于亞熱帶地區(qū)的一種大型腐生菌，也是一種土生的食用菌。子實(shí)體一般大型，菇柄粗長(zhǎng)；質(zhì)地脆嫩，風(fēng)味宜人，食味較美，含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素及礦物質(zhì)等，尤以人體必需氨基酸含量高而著稱，是一種很有開發(fā)前景的食用菌新品種。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于高大環(huán)柄菇的人工栽培已有相關(guān)報(bào)道，Boyer研究發(fā)現(xiàn)可用雙孢菇堆肥進(jìn)行人工栽培，丁智權(quán)等也報(bào)道了其栽培技術(shù)，但關(guān)于高大環(huán)柄菇的大面積推廣應(yīng)用仍未見報(bào)道，究其原因?yàn)楫?dāng)前對(duì)該菌的研究不深人、缺乏基礎(chǔ)數(shù)據(jù)來(lái)支撐其配套栽培技術(shù)。因此，為更好地開發(fā)利用這一野生菌，筆者在前人研究的基礎(chǔ)上，采用菌絲生長(zhǎng)速度、菌絲體干質(zhì)量和生長(zhǎng)勢(shì)等指標(biāo)對(duì)1株野生高大環(huán)柄菇的生物學(xué)特性進(jìn)行研究，篩選出最佳的生長(zhǎng)條件，為其人工栽培及推廣應(yīng)用提供技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.2野生菌母種分離

2014年8月25日在吉林省白河林業(yè)局黃松蒲林場(chǎng)采集一種大環(huán)柄菇屬真菌，組織分離獲得該野生菌的母種。

1.3野生菌株鑒定

1.3.1形態(tài)學(xué)鑒定 肉眼觀測(cè)野生子實(shí)體的外表形態(tài)以及周圍生境。觀察菌絲體在固體培養(yǎng)基上菌落的形狀、大小、顏色、味道、生活力等。光學(xué)顯微鏡觀測(cè)擔(dān)孢子形態(tài)，并采用平板斜插蓋玻片法觀測(cè)菌絲鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)、細(xì)胞大小、形態(tài)等。

1.3.2分子鑒定 利用ITS1和ITS4通用引物對(duì)分離的野生菌株進(jìn)行ITS-PCR鑒定。

1.4野生高大環(huán)柄菇的生物學(xué)特性研究

碳源、氮源、碳氮比、生長(zhǎng)因子、溫度、pH值等試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[7—9]中的方法。

1.5測(cè)定方法

1.5.1菌絲的平均生長(zhǎng)速度 將黃傘菌種接種于平板培養(yǎng)基表面的中央，培養(yǎng)8 d后測(cè)量菌落半徑，以菌落平均半徑除以時(shí)間即為菌絲的日平均生長(zhǎng)速度。

1.5.2菌絲干質(zhì)量 將測(cè)定完生長(zhǎng)速度的平皿放人高壓鍋內(nèi)121℃加熱至培養(yǎng)基融化（10 min），趁熱將菌絲取出置于單層紗布上，熱水浴1 h，然后置于烘干箱內(nèi)105℃烘干至恒質(zhì)量，稱量。

1.5.3生長(zhǎng)勢(shì)的測(cè)定 菌絲生長(zhǎng)濃密、長(zhǎng)勢(shì)旺盛，用“+++-4-”表示；菌絲生長(zhǎng)較密、長(zhǎng)勢(shì)較好，用“+++”表示；菌絲生長(zhǎng)密、長(zhǎng)勢(shì)一般，用“++”表示；菌絲生長(zhǎng)稀、長(zhǎng)勢(shì)較弱，用“+”表示；菌絲不生長(zhǎng)，用“-”表示。

2結(jié)果與分析

2.1野生菌株的鑒定結(jié)果

2.1.1形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果 子實(shí)體（圖1）一般大型，菌蓋直徑17～30 cm，中部褐色，有銹褐色鱗片；菌肉白色，較厚；菌褶白色，較密，離生，不等長(zhǎng)；菌柄長(zhǎng)15～38 cm，粗0.6～2.0 cm，柱形，向下漸粗，褐色，略扭轉(zhuǎn)，基部膨大，有可移動(dòng)菌環(huán)；孢子印白色，孢子無(wú)色，光滑，卵圓形，（13～18）μm×（10～12）μm。

2.1.2分子鑒定結(jié)果 利用ITSl和ITS4通用引物對(duì)野生菌株進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序。對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BTJAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)序列與登錄號(hào)為HMl25514.1的高大環(huán)柄菇菌株同源性達(dá)到99.85%。因此，結(jié)合子實(shí)體形態(tài)可確定分離菌株為高大環(huán)柄菇。野生高大環(huán)柄菇菌株的ITS序列為：5′-TTTGAGGTCAATTTTCAGTATAATrGTCCATGAAGACTGGACGATTGGCAGCTGAACAGACAGAGAGCGACCACACGGCGTAGATAATTATCACACCTGTGACGGATCGCAAACGGTTCCGCTAATGCATTTCAGAGTAGCTGACCTTTAAAAGGCCAGCAAACCTCCATATCCAAGCCCCATCACAGAAAACTGGAGGGGTTGAGAATTTAATGACACTCAAACAGGCATGCTCCTCGGAATACCAAGGAGCGCAAGGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCAAGAGATCCGTTGCTGAAAGTTGTATAGATCATTTATAGGCACAAAGGCCCATTGAATACATTCTACAACATACTATGTGGTATATGAAAACATAGACTCCAGGGAAGGTTCACAACCATTTGAGGAGAGCTGCACTTTTTTTTTTGCGCAAGCATTCCTCACATCCGAGAAGACTCGATAGGTGGCTGCTCTCAATCCCTAGAAGACTACAAAAGGTGCACAGGTGGATGAATAAAAAACAAGACAGGTGTGCACAATGCCCCGGAGAGCCAGCTACAACCCATCAAGTATATTCAATAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAA-3′。

2.2野生高大環(huán)柄菇的生物特性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1碳源對(duì)高大環(huán)柄菇菌絲生長(zhǎng)的影響 試驗(yàn)結(jié)果（表1）表明，高大環(huán)柄菇菌株對(duì)供試碳源都能利用，但不同碳源問高大環(huán)柄菇菌絲生長(zhǎng)速度、菌絲體干質(zhì)量和長(zhǎng)勢(shì)差異顯著。其中，該菌株在對(duì)照培養(yǎng)基和以淀粉、蔗糖和山梨醇為碳源的培養(yǎng)基上日生長(zhǎng)速度較快，但差異不顯著；在以淀粉為碳源的培養(yǎng)基上，菌絲生長(zhǎng)勢(shì)旺盛，干質(zhì)量最高，達(dá)0.038 8 g，且與其他3種碳源差異顯著。因此，本試驗(yàn)選取的最佳碳源為淀粉。

2.2.2氮源對(duì)高大環(huán)柄菇菌絲生長(zhǎng)的影響 試驗(yàn)結(jié)果（表2）表明，高大環(huán)柄菇菌株在不同氮源培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度差異顯著。菌絲生長(zhǎng)速度以大豆蛋白胨最快；其次是酵母浸粉；最慢的是對(duì)照。從菌絲干質(zhì)量來(lái)看，牛肉浸膏最高；其次是大豆蛋白胨；大豆粉最差。從菌絲生長(zhǎng)勢(shì)來(lái)看，以大豆蛋白胨為氮源的菌絲濃密，長(zhǎng)勢(shì)最佳；其次為酵母浸粉；大豆粉和對(duì)照最差。因此，本試驗(yàn)選用大豆蛋白胨作為最佳氮源。

2.2.3碳氮比對(duì)高大環(huán)柄菇菌絲生長(zhǎng)的影響 由表3可以看出，不同碳氮比對(duì)高大環(huán)柄菇菌絲生長(zhǎng)影響明顯。高大環(huán)柄菇菌絲在碳氮比為（10～60）：1范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)，但以（10～30）：1生長(zhǎng)較適宜，在此之間菌絲生長(zhǎng)速度較快且差異不顯著。碳氮比在（50～60）：1之間，菌絲生長(zhǎng)緩慢。從菌絲干質(zhì)量來(lái)看，碳氮比為10：1時(shí)，菌絲干質(zhì)量較高但與碳氮比為20：1的培養(yǎng)基差異不顯著；碳氮比在（50～60）：1之間，菌絲干質(zhì)量最差。因此，本試驗(yàn)選用碳氮比為20：1。

2.2.4生長(zhǎng)因子對(duì)高大環(huán)柄菇菌絲生長(zhǎng)的影響 試驗(yàn)結(jié)果（表4）表明，不同生長(zhǎng)因子對(duì)高大環(huán)柄菇菌絲生長(zhǎng)存在一定的影響，其中維生素B₁、維生素B₂和肌醇的菌絲生長(zhǎng)速度最快，且三者之間差異不顯著；維生素C最差。從菌絲干質(zhì)量來(lái)看，維生素B₂、肌醇、維生素B₁和玉米漿的菌絲體干質(zhì)量較高，且四者問差異不顯著；維生素C最低。因此，本試驗(yàn)選維生素B₁作為最佳生長(zhǎng)因子。

2.2.5溫度對(duì)高大環(huán)柄菇菌絲生長(zhǎng)的影響 試驗(yàn)結(jié)果（表5、圖2）表明，不同溫度處理對(duì)高大環(huán)柄菇菌株生長(zhǎng)速度具有顯著的影響。在16～32℃之間菌絲均能正常生長(zhǎng)，但24～28℃最適宜，其中在28℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)速度、菌絲體干質(zhì)量、生長(zhǎng)勢(shì)均較優(yōu)；當(dāng)溫度低于24℃時(shí)，雖然菌絲仍然潔白稠密，但生長(zhǎng)速度減慢；當(dāng)溫度達(dá)到36℃時(shí)，菌絲完全停止生長(zhǎng)。因此，本試驗(yàn)選取的最適培養(yǎng)溫度為28℃。

2.2.6 pH值對(duì)高大環(huán)柄菇菌絲生長(zhǎng)的影響 從表6可以看出，高大環(huán)柄菇菌絲在pH值為5.0～8.5之間均能生長(zhǎng)；當(dāng)pH值大于8.5時(shí)，高大環(huán)柄菇菌絲不能生長(zhǎng)。在pH值為5.0、7.0時(shí)，菌絲生長(zhǎng)較快，且差異不顯著。從菌絲體干質(zhì)量來(lái)看，pH值為5.0、6.0時(shí)，菌絲體干質(zhì)量較高，且兩者之間差異不顯著。從菌絲生長(zhǎng)勢(shì)來(lái)看，當(dāng)pH值為7.0時(shí)，菌絲長(zhǎng)勢(shì)最旺；其次是pH值為5.0、6.5；菌絲在pH值為8.0～8.5之間時(shí)長(zhǎng)勢(shì)較弱；當(dāng)pH值為9.0時(shí)，菌絲不能生長(zhǎng)。因此，本試驗(yàn)選取的最適pH值為7.0。

3結(jié)論與討論

在歐洲、亞洲和非洲的許多國(guó)家和地區(qū)，高大環(huán)柄菇是很名貴的菌類，該菌不但適于鮮銷，還適于制罐或制干，因菇柄粗且長(zhǎng)，干物質(zhì)含量高，是很好的加工原料，具有很高的推廣價(jià)值。目前，關(guān)于大型真菌的生物學(xué)特性的研究報(bào)道較多，但多數(shù)以菌絲生長(zhǎng)速度和生長(zhǎng)勢(shì)作為衡量指標(biāo)，篩選其最適生長(zhǎng)條件。菌絲干質(zhì)量是指菌株利用碳源、氮源等營(yíng)養(yǎng)成分，合成自身結(jié)構(gòu)物質(zhì)烘干后的質(zhì)量；在一定程度上可以反映菌株利用營(yíng)養(yǎng)成分的強(qiáng)弱，作為菌株健壯程度的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。本研究采用菌絲日生長(zhǎng)速度、菌絲體干質(zhì)量和菌絲生長(zhǎng)勢(shì)等指標(biāo)對(duì)野生高大環(huán)柄菇菌株的生物學(xué)特性進(jìn)行綜合分析評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，該菌適合的碳源選擇比較廣，在以淀粉、蔗糖和山梨醇為碳源的培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)速度、菌絲干質(zhì)量及生長(zhǎng)勢(shì)都比較好，該結(jié)果與馮飛等報(bào)道的一種大環(huán)柄菇屬（Macrolepiota sp.）真菌的最適碳源一致，結(jié)合菌絲干質(zhì)量，選擇淀粉為最適碳源；在氮源利用方面，該菌對(duì)氮源的選擇比較窄，最適氮源為大豆蛋白胨，這與荷葉離褶傘、黃傘菌株的最適碳源一致；適宜的碳氮比為（10～30）：1，最適碳氮比為20：1；最適生長(zhǎng)因子為維生素B₁，這與馮飛等報(bào)道的結(jié)論一致；高大環(huán)柄菇菌絲體生長(zhǎng)適宜的溫度范圍為24～28℃，最適溫度為28℃，這與馮飛等報(bào)道的最適溫度為25℃不一致，主要可能是因?yàn)樵囼?yàn)所采用的培養(yǎng)箱精密度不一樣，筆者近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)多數(shù)食用菌的最適生長(zhǎng)溫度為28℃；最適pH值為7.0，該結(jié)論與丁智權(quán)報(bào)道的最適pH值為6.5～7.2相吻合。目前，未見其他關(guān)于高大環(huán)柄菇最適氮源、碳源、碳氮比及最適生長(zhǎng)因子的綜合研究報(bào)道，本研究結(jié)果可為高大環(huán)柄菇的人工栽培及推廣應(yīng)用提供一定的依據(jù)。