不結球白菜同源四倍體種質創建及特性研究

王夏　孫菲菲　酈月紅　王強　孫雪花　劉慶葉

摘要：利用優良二倍體不結球白菜華鳳為試驗材料，采用秋水仙素活體誘導其生長點，旨在創建同源四倍體種質。通過形態學比較、流式細胞儀測定遺傳物質含量等方法鑒定了變異植株倍性，從中篩選獲得了同源四倍體。在此基礎上，選取3個優異同源四倍體自交系為研究對象，發現四倍體的營養品質提高，花期延長約10 d，結實率達到了應用的水平。研究結果表明，不結球白菜同源四倍體種質具有良好的應用前景。

關鍵詞：不結球白菜；同源四倍體；秋水仙素；種質創新

中圖分類號：S634.302 文獻標志碼：A 文章編號：1002—1302（2016）01—0173—03

不結球白菜別稱青菜、小白菜，是我國廣泛種植的蔬菜種類，如今正逐漸成為世界性蔬菜。不結球白菜營養豐富、適應性強、生長快速、易種植，特別適合作為穩定蔬菜價格的“杠桿”類蔬菜種植。因此選育耐熱耐抽薹的不結球白菜新品種具有促進不結球白菜生產的意義，而多倍體獨特的基因劑量效應促使多倍體在抗逆性上具有更強的優勢，目前在不結球白菜新品種選育中已經有所應用，四倍體矮腳黃、熱優2號等品種已經走向市場。四倍體不結球白菜通常具有植株個體增大、營養價值提高、抗逆性增強等優點，但是具有多倍體常見的育性下降、制種產量低等不足，如1個成熟的四倍體往往需要經過6～7代的馴化，才能基本達到生產應用的水平。因此，我們認為將四倍體作為新的種質資源，利用多倍體在基因突變、遠緣雜交、固定雜種優勢等方面的特點更加有效。本研究利用已有的技術手段，通過綜合應用，將為不結球白菜異源四倍體種質創新構建高效的方法。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗材料為二倍體青梗菜品種華鳳，由廣州農鑫農業科技有限公司銷售。四倍體矮腳黃由南京農業大學提供。試驗于2012年9月20日至2014年5月26日在南京市蔬菜科學研究所橫溪蔬菜科技園進行。

1.2四倍體誘導

2012年9月20日穴盤育苗200株，出苗后問苗、齊苗。待子葉展開，尚未破心之前用0.2%秋水仙素溶液點滴生長點，每次20μL，每天上、下午各處理1次，處理2 d。

1.3四倍體鑒定篩選方法

1.3.1形態學鑒定 形態學鑒定的原則是肉眼可見，主要包括葉形、葉色、花器官、角果、種子等。在形態學鑒定篩選過程中，將可疑株一律拔除。

1.3.2群體篩選 2013年9月25日，將一代自交種子按單株播種，調查群體的一致性。嵌合體在加倍過程中普遍存在，雖然通過形態學鑒定之后，部分被淘汰，但不一定完全。因此，在群體調查過程中，淘汰具有明顯分離現象的群體。

1.3.3流式細胞儀倍性分析 流式細胞儀分析法可迅速測定細胞核內DNA的含量和細胞核的大小，是大范圍鑒定倍性快速有效的方法。測定由南京農業大學協助完成，方法參照文獻[4]。每個群體隨機抽取5株進行測定，以二倍體為對照。

1.4四倍體留種

對鑒定為四倍體的誘變植株M₀代，進行嚴格的單株蕾期人工授粉。2013年5月單株收種M₁代并統計結實率，同年9月選擇結實性高的單株播種，每株系自成小區。從葉柄寬、厚，葉色亮綠、束腰緊湊的株系中篩選優質單株嚴格自交留種，統計單株結實率（結實率=結籽數/角果數）。2013年9月重復上述步驟，收獲M₂代自交種。M₁、M₂代小區試驗面積3 m×2 m，定植數量80棵，10月下旬定植，12月中下旬采收。

1.5四倍體營養品質調查

2013年11月5日選取標準棵菜進行測定，葉片和葉柄2個部位分開進行，3次重復，測定樣品選取部位一致。營養品質測定的指標有可溶性蛋白質含量、可溶性糖含量、硝態氮含量、維生素C含量、粗纖維含量。考馬斯亮藍G-250染色法測蛋白質含量；蒽酮-硫酸比色法測定可溶性糖含量；水楊酸比色法測定硝態氮含量；液相色譜法測定維生素C含量；粗纖維含量測定參考康琪等的方法。數據使用Excel分析。

1.6四倍體育性調查

2014年春季觀察四倍體花期情況并單株套袋自交留種，以四倍體矮腳黃為對照。

2結果與分析

2.1多重篩選的效果

受低溫影響，200株處理植株中15%死亡，30%的植株受凍害影響嚴重，生長緩慢，營養生長積累不足，但對照生長正常。形態學鑒定過程中淘汰30%植株，主要是疑似嵌合體和畸形體。套袋自交之后，結籽單株44株，占總處理的22%，其中種子數量超過25粒的28株，占總處理的14%；種子數量超過50粒的16株，占總處理的8%；種子數量超過100粒的3株，占總處理的1.5%。將種子量達到50粒的播種育苗定植，其中無分離群體10個，挑選了其中3個群體進行抽樣調查，進行形態學比較和流式細胞儀分析。

2.2二倍體、四倍體形態學比較

四倍體在不同生長時期形態上的變化很多，特征典型，這也是四倍體篩選的重要一步。相對于二倍體，四倍體的葉片肥厚、色澤加深、花朵變大、果莢變小、種子增大（圖1）。

2.3流體細胞儀倍性分析

在多重篩選的基礎之上，流式細胞儀分析結果顯示來自3個群體的15株植株都是四倍體。圖2中縱坐標Count值代表測定細胞數的相對值，橫坐標FL3值代表熒光的通道值，峰值的位置反映的是測試樣品的倍性。雜合二倍體DNA相對含量在80和180附近，疑似株DNA相對含量在160和360附近，約是對照的2倍，表明是四倍體。因此，通過對雜交小白菜品種華鳳的加倍，成功創建了新的異源四倍體種質，命名4X。

2.4二倍體、四倍體品質調查

四倍體不結球白菜品質優于二倍體，其中四倍體葉柄部分比二倍體葉柄部分的可溶性糖含量增加11.35%，差異極顯著；維生素C含量增加28.57%，差異不顯著；硝酸鹽含量降低11.64%，差異不顯著；可溶性蛋白質含量增加75%，差異極顯著；粗纖維含量降低31%，差異顯著。四倍體葉片部分比二倍體葉片部分的可溶性糖含量增加40.74%，差異顯著；維生素c含量增加53.15%，差異顯著；硝酸鹽含量降低10.16%，差異不顯著；可溶性蛋白質含量增加27.48%，差異顯著；粗纖維含量降低27.31%，差異極顯著（表1），這與鄧云等的研究結果相似。

2.5異源四倍體花期與結實率調查

田間觀察比較發現，四倍體與二倍體F₁的始花期基本一致，但四倍體3個姊妹系的花期比二倍體長10 d左右。四倍體不同單株之間結實率有差異，但與四倍體矮腳黃對比，結籽情況相似。

3討論

蔬菜多倍體育種是蔬菜育種的一條重要途徑。多倍體育種在不結球白菜品種選育中取得了巨大的成果，但已報道的不結球白菜加倍處理多利用自交系材料，本研究中利用F₁雜合體進行加倍，形成同源四倍體是一種新的嘗試。采用雜合體進行加倍，能夠快速聚集親本的優良性狀，保證了四倍體種質價值的同時縮短了時間。另外，F₁雜合體比多世代自交系具有更強的生長勢，實際生長中的一致性更容易體現，對材料中的二倍體雜株和異常株的剔除相對更加容易，但是高純度的F₁雜合體種子的獲取難度相對較大，尤其是手工配制產生的F₁材料，需要高純度的自交系親本和人工剝蕾雜交，收集的種子除了加倍試驗，還需要考慮多代的對照材料問題。

加倍之后的四倍體鑒定篩選是四倍體種質創新的關鍵，通常包括形態學比較、染色體計數、流式細胞儀分析等。二倍體加倍之后，由于基因劑量效應，植株器官發生變化，抗逆性能夠增強，而形態學比較及逆境脅迫篩選是在此基礎之上的合理運用，如在西瓜四倍體鑒定中，溫度脅迫篩選的方法鑒定的倍性符合度超過80%。通過比較自然低溫條件下不結球白菜二倍體與四倍體可溶性糖、可溶性蛋白質的變化規律，發現四倍體比二倍體更加耐寒，這一研究結果也表明溫度篩選不結球白菜也是可能的，只是目前不結球白菜低溫脅迫與四倍體篩選的方法尚不完備，還需進一步研究。

不結球白菜四倍體的育性一般低于二倍體，這是因為在染色體加倍的過程中，由于基因重復，基因重組與變異大量發生，使原有的基因表達調控機制產生了暫時的紊亂，而四倍體經過多代的馴化，育性往往又能夠進一步恢復。同時每個植株在加倍過程中產生的基因重組與變異是不同的，因此我們認為在創建四倍體種質的過程中，首先需要篩選的是具有較好育性的材料，對四倍體初代開始通過套袋自交、輔助傳粉的處理手段，在一種苛刻的選擇條件下篩選適合的育種材料，既減少了工作量，也有助于得到育性較好的個體，為四倍體種質資源的利用打下基礎。在此研究中得到的四倍體材料具有營養品質提高、花期延長、結實率較高等特點，作為育種材料將具有良好的應用前景。