元江蘆薈根際放線菌的分離與鑒定

丁雅迪　繆福俊　毛德昌　吳正富　熊智

摘要：開展元江蘆薈根際放線菌的研究，為促進元江蘆薈的生長及品質的改良提供理論基礎。采用涂布平板法對蘆薈根際放線菌進行分離純化，再對純化的放線菌進行形態顯微結構觀察、生理生化及系統發育樹構建分析。結果表明，從元江蘆薈根際土壤中共分離鑒定出3株放線菌，屬于鏈霉菌屬的小鏈霉菌（Streptomyces parvus）、早期鏈霉菌（Streptomyces praecox）及克蘭斯基鏈霉菌（Streptomyces krainskii）。研究結果將為蘆薈病害的生物防治提供應用資源。

關鍵詞：元江蘆薈；根際放線菌；分離鑒定；系統發育樹；生物防治

中圖分類號：S182 文獻標志碼：A 文章編號：1002—1302（2016）01—0154—04

放線菌是革蘭氏陽性菌，其物種及G+C含量豐富，具有明顯分枝的菌絲體，廣泛分布于自然界，主要分布于土壤、海洋、植物體內及一些極端環境中。隨著放線菌在人們生活中的普遍使用，賦予其巨大的市場經濟價值；并且由于放線菌能夠產生豐富的生物活性物質，其中包含大量抗生素，使其具有較強的生物修復能力，目前有2/3的抗生素被廣泛應用于農業、林業和臨床醫學等方面。近年來，隨著人們對植物根際區域研究的不斷深入，發現從放線菌的天然棲居地土壤中僅能分離出1/10的放線菌，而根際土壤中含有大量微生物類群，其數量遠多于非根際土壤中的微生物類群。根際土壤放線菌形成的生物活性物質也明顯高于非根際土壤放線菌，根際土壤放線菌不僅能夠分解土壤有機質，為植物制造養料，還具有產生碳酸氣、有機酸的能力，使土壤中難溶性物質溶解。因此，開展根際土壤放線菌的研究意義重大，有望開辟放線菌新藥物及具有活性的次級代謝產物的新資源。目前對植物根際放線菌研究不多，主要集中于海洋放線菌、植物內生放線菌、特殊環境放線菌等方面，國內外針對元江蘆薈根際放線菌的研究未有報道。蘆薈因具有藥用、食用、美容及保健等方面的功能而得到廣泛應用，主要分布于云南、廣東、海南、四川、福建等熱帶地區。本研究選擇云南元江蘆薈（Aloe yuanjiangensis）根際土壤作為研究對象，采用選擇性分離方法、形態結構特征觀察法、生理生化性質分析法及系統發育樹分析法對放線菌進行鑒定，以期為后期優化出拮抗蘆薈根腐病病原菌的放線菌奠定基礎，并提高其在農林保護及醫學研究等方面的應用價值。

1材料與方法

1.1試驗材料

選取云南野生元江蘆薈（A.yuanjiangensis）種植地作為目標地，采集10份根際混合土樣作為分離樣品，實驗室自然風干備用。

主要培養基為：高氏一號培養基，配方參見文獻[22]；TWYE培養基（0.025%酵母浸膏，0.05%K2HP04，1.8%瓊脂，加水至1000 mL，調節pH值為7.2）、YIM38號培養基（0.4%酵母浸膏，0.4%葡萄糖，0.5%麥芽膏，微量復合維生素，1 mL微量鹽，1.5%瓊脂，加水至1 000 mL，調節pH值為7.2）。為抑制細菌生長，倒平板前分別于上述3種培養基中加入3.3 mL無菌0.01%重鉻酸鉀溶液。

1.2主要儀器

主要儀器有：微波爐（格蘭仕）；高壓蒸汽滅菌鍋（上海博迅實業有限公司）；冷凍型臺式高速離心機（MIKRO 220R）；普通離心機（德國艾本德）；超凈工作臺（Airtech）；恒溫培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）；水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；光學顯微鏡（上海比目儀器有限公司）；凝膠成像系統（英國Syngene）；PCR自動系列化分析儀（德國Biome-tra）。

1.3試驗萬法

1.3.1土壤稀釋液的制備 稱取1 g自然風干的健康蘆薈根際土壤，研缽碾碎過篩，高溫烘干（100℃，1 h），加入已準備好的帶有磁珠的99 mL無菌水中，低速搖床（170 r/min，30℃）處理1 h，再微波處理30 s，混勻后即得稀釋100倍的土壤懸液。取1 mL稀釋100倍的土壤懸液加入到含有9 mL無菌水的試管中，搖勻即得稀釋1000倍的土壤懸液。再取1 mL稀釋1 000倍的土壤懸液同樣加入到含有9 mL無菌水的試管中，搖勻后得到稀釋1萬倍的土壤懸液。根據此法依次得到稀釋10萬倍、100萬倍的土壤懸液。

1.3.2放線菌的分離純化 采用涂布平板法吸取1 mL稀釋1萬倍的健康蘆薈根際土壤稀釋液，依次涂布于高氏一號、TWYE、YIM38號平板中。稀釋10萬倍、100萬倍的健康蘆薈根際土壤稀釋液采用同種方法涂布。28℃下恒溫培養7～15 d。將分離出的放線菌菌落挑出，經過多次純化接種到相應斜面培養基中保存，置于4℃冰箱中保存備用。

1.3.3放線菌的形態鑒定 采用分區劃線法觀察放線菌菌落特征，采用插片法觀察放線菌的形態特征，用無菌鑷子取數塊無菌蓋片，以45°角分別斜插于接有放線菌的高氏一號、TWYE、YIM38號平板，每個平板插4片，28℃培養5～7 d，結晶紫染色顯微鏡下觀察拍照。

1.3.4生理生化鑒定 按照梁銀等的方法對放線菌進行常規酶學性質的研究，并對碳源利用情況進行研究。

1.3.5菌株DNA的提取及系統發育樹構建 采用酶解法小量提取蘆薈健康根際放線菌DNA。25 IxL PCR反應體系：各1μLPA、PB，12.5μL 2×Taq PCR Master Mix，1 μL DNA模板，ddH₂O補足至25μL。16 s rDNA PCR擴增常用引物及擴增條件參照陳森洲等方法。取4.0μLPCR擴增產物通過1.2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，其余產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司純化并測序。采用MEGA5.1軟件進行多序列的比對，對比對結果進行系統發育樹的構建，以確定菌株的種屬地位。

2結果與分析

2.1放線菌分離的鑒定

從蘆薈根際土壤中共分離得到3株放線菌，依次命名為LHFXJ01、LHFXJ02、LHFXJ03。對這3株放線菌進行培養發現，菌株生長緩慢，菌落密集如氈、具粉狀凸起及明顯褶皺，菌落小而不擴散（圖1）。氣生菌絲呈現乳白色、灰色、黃白色，基質菌絲的顏色呈現黃色、灰色，可溶性色素包括黃色、灰白色。顯微鏡下觀察可知：菌絲細且發達，逐漸形成孢子絲；孢子絲或長而直，或短而柔曲；孢子成熟后脫落，形成具橢圓形、卵圓形、球形等孢子（圖2）。因此結合培養特征、形態特征初步判定這3株放線菌為鏈霉菌屬（Streptomyces sp.）的不同種。

2.2生理生化特性鑒定

采用常規酶學指標檢測試驗對菌株LHFXJ01、LHFXJ02、LHFXJ03生理生化性質進行檢測。由表1可知，3株放線菌均能使明膠液化、牛奶胨化、淀粉水解、硝酸鹽還原、纖維素水解，只是部分菌株作用效果緩慢。除菌株LHFXJ02使牛奶凝集慢，其他菌株不能使牛奶凝集。3株菌均能夠利用D-葡萄糖、D-甘露醇、L-阿拉伯糖，不能利用蔗糖、棉子糖和肌醇作為碳源，其中菌株LHFXJ01、LHFXJ02還能夠利用D-果糖、D-木糖、鼠李糖作為碳源，菌株LHFXJ03則不能。這些結果與鏈霉菌屬特征吻合。

2.3放線菌16SrDNA PCR擴增及序列測定

蘆薈根際放線菌的16S rDNA經PCR擴增，獲得1500 bp左右PCR產物，擴增結果見圖3，剩余產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。所得菌株16S rDNA序列在GenBank中注冊，獲得GenBank登錄號（KR258748-KR258750）。

2.4系統發育樹的構建

將序列提交至NCBI中的GenBank中進行BLAST同源比對，選取同源性最高的序列進行多序列比對，通過MEGA 5.1使用最大簡約性法（maximum parsimony）構建系統發育樹，確定該菌株的種屬地位。從圖4、表2可以看出，青霉屬（Peni-cillum sp.）（KJ527027）為外類群，從系統發育樹中可以看出LHFXJ01（KR258748）與小鏈霉菌（Streptomyces parvus）（JX203385.1）在同一個系統發育分支，相似度為99.9%；LH-FXJ02（KR258749）與早期鏈霉菌（Streptomyces praecox）（JQ924403.1）在同一個系統發育分支，相似度為99.8%；LH-FXJ03（KR258750）與克蘭斯基鏈霉菌（Streptomyces krainskii）（ABl84278.1）在同一個系統發育分支，相似度為99.9%。可以判定LHFXJ01（KR258748）為Streptomyces parvus（JX203385.1）；LHFXJ02（KR258749）為Streptomyces praecox（JQ924403.1）；LHFXJ03（KR258750）為Streptomyces krainskii（AB184278.1）。

3結論與討論

經培養特征、形態結構特征、部分常規生理生化性質及系統發育分析相結合的方法進行鑒定，結果表明，分離的3株放線菌屬于鏈霉菌屬（Streptomyces sp.）的3個種，分別為Strep-tomyces parvus、Streptomyces praecox、Streptomyces krainskii。這將有助于探索防治蘆薈病害的生物途徑，使蘆薈具有更高的醫療、美容、保健、食用等價值。

分離純化的3株放線菌都是鏈霉菌屬，這與廖振林等從廣西北海紅樹林土壤中分離到鏈霉菌屬占4/5的結論。一致；也符合司美茹等從濟寧市土壤放線菌中分離得到鏈霉菌屬占70%以上的研究結果。本試驗中未分離純化出放線菌的其他種屬，可能與土樣的預處理、培養基的選擇、采樣時間、地點及分離方法等方面因素有關，有待進一步研究。

鏈霉菌屬菌株可為人類源源不斷地提供天然活性物質，能夠提供約占臨床醫學67%的具有重大應用價值的抗生素。前人研究表明：鏈霉菌屬產生的生物活性物質包括抗菌劑、免疫抑制劑、抗腫瘤劑、抗蟲劑等。隨著土壤中放線菌菌株的不斷發現，從這些普通環境中探索出新的生物活性物質產生菌難度日益增大，隨著人類對活性物質需求的不斷增多，加速了探索新的活性物質領域的進程。本試驗未對從蘆薈根際土壤中分離純化的3株鏈霉菌屬菌株進行生物活性物質及抗菌能力測定，蘆薈根際放線菌菌株鏈霉菌屬具備產生何種生物活性物質的能力還有待于進一步深入研究。