防治臍橙炭疽病生防菌的篩選

張曉媛+賴聞玲+許楊

摘要：采用杯碟法測定枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）、木霉菌（Trichodermaspp）、瓦克青霉（Penicillium waksmanii）、白淺灰鏈霉菌（Streptomyces albo-griseolus）對臍橙炭疽病病原菌菌株GXA5-1的防治效果。試驗結果顯示，白淺灰鏈霉菌抑制菌絲體生長的效果最顯著，在不同稀釋度下的相對抑制率都是最大的，稀釋10、100、200倍的相對抑制率為96.31%、85.82%、62.69%。枯草芽孢桿菌抑制孢子萌發的效果是最顯著的，稀釋10、100、200倍的相對抑制率分別為89.93%、67.59%、48.76%。

關鍵詞：臍橙炭疽病；生防菌；生物防治

中圖分類號：S436.661.14 文獻標志碼：A 文章編號：1002—1302（2016）01—0152—02

炭疽病是嚴重危害農作物生產和農產品儲運的一大真菌性病害，具有危害廣和危害時間長的特點，主要侵害農作物葉片、枝條、花、果實和果柄，常造大量落葉、枝條枯死、落花、落果和果實腐爛。炭疽病的病原菌因植物不同而有所不同，主要由半知菌亞門腔孢綱黑盤孢目炭疽菌屬（Colletotrichum）中的真菌引起。炭疽病病原一般可直接在寄主上產生無性繁殖階段，而有性繁殖階段則很少見到。

引起柑橘炭疽病的病原菌無性階段是半知菌亞門炭疽菌屬的膠孢炭疽菌（CoUetotrichum gleosporioides Penz），有性階段為子囊菌門小叢殼屬（Glomerella cingulata Stonem），該病菌寄主范圍廣，能侵害多種熱帶、亞熱帶和溫帶農產品品種。在很多情況下炭疽病是多種病原菌相互作用引起的，例如c.gloeosporioides、C.acutatum和C.fragariae引起草莓炭疽病。

目前，防治炭疽病主要依靠化學藥物。眾所周知化學殺菌劑的長期泛濫使用，極易增強病原菌的耐藥性。根據美國加利福尼亞的調查，抑霉唑在柑橘上連續使用5年以后，出現了抗抑霉唑菌株指狀青霉。化學殺菌劑的濫用造成土壤、空氣的二次污染及農產品中的殘留農藥超標，再次威脅環境和人類健康。因此植物炭疽病的防治研究開始轉到生物技術應用上來。部分用于防治農產品采后炭疽病害的安全有效的生物制劑已經研發出來，國內外對拮抗菌篩選及采后果害的研究也取得了一定的成果。但是在柑橘屬農產品上，至今尚未發現能抑制炭疽病菌達12 h以上的生物殺菌劑。本研究立足于地方臍橙產業中炭疽病害頻發現狀，旨在篩選出經濟、安全、高效的抑菌菌株，為進一步進行田間試驗和微生物農藥的選育提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1培養基 細菌培養基采用牛肉膏蛋白胨培養基（牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，水1000 mL，pH值7.0～7.2，121℃滅菌20 min）。真菌培養基采用PDA培養基（馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，121℃滅菌20 min）。

1.1.2供試菌株 炭疽病致病菌株GXA5-1，分離自江西省贛州市贛縣梅林果園臍橙炭疽病發病病葉。按照科赫氏法則完成病原菌的分離純化、鑒定及致病性測定，確認為膠孢炭疽菌。枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluores-cens）、木霉菌（Trichodermaspp）、瓦克青霉（Penicillium waks-manii）、白淺灰鏈霉菌（Streptomyces albogriseolus）購于中國農業微生物菌種保藏管理中心。

1.1.3生防菌處理液的制備 枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、熒光假單胞菌于100 mL牛肉膏液體培養基37℃、150 r/min振蕩活化12 h，取菌液5 mL加至95 mL牛肉膏液體培養基中，37℃、150 r/min振蕩培養，渾濁后以4 000 r/min離心10 min，取上清備用。

木霉菌、瓦克青霉接種至查彼固體培養基，25℃培養3 d，再轉接至液體培養基，25℃、150 r/min振蕩培養，出現大量菌絲后過濾，4000 r/min離心10 min，取上清備用。

白淺灰鏈霉菌接種至高氏一號固體培養基，28℃活化培養2 d，再轉接至液體培養基，28℃、150 r/min振蕩培養，渾濁后以4 000 r/min離心10 min，取上清備用。

1.1.4菌株處理液對臍橙炭疽病病原菌菌絲生長的影響采用杯碟法，配制含有生防菌處理液的PDA平板，稀釋度為10、100、200倍。直徑4 mm的打孔器切取菌塊，移植至含有生防菌處理液的PDA平板中央，28℃下培養。3 d后測量菌落直徑，記錄生長情況。不含處理液的PDA平板，作為對照。每個菌株做3次重復，計算相對抑制率。

1.1.5菌株處理液對臍橙炭疽病病原菌孢子萌發的影響制備濃度為5×10⁴個/mL的孢子懸浮液。將生防菌處理液和孢子懸浮液稀釋10、100、200倍，滴在無菌凹玻片上，28℃保濕培養18 h后鏡檢，3次重復，無菌水做對照。每處理500個孢子，計算孢子萌發率和抑制率。

2結果與分析

2.1不同生防菌處理液對臍橙炭疽GXA5-1菌絲生長的抑制作用

從表1可以看出，在相同濃度下，各生防菌對病原菌的生長影響表現有顯著性差異，白淺灰鏈霉菌的抑制效果最顯著，在不同稀釋度下的相對抑制率都是最大的。細菌中蘇云金芽孢桿菌的防治效果不明顯，枯草芽孢桿菌的防治效果較顯著。蘇云金芽孢桿菌比其他生防菌的抑制率都低，在稀釋10倍時抑制率為42.69%。相同生防菌菌株隨著濃度下降，對病原菌菌絲生長的抑制率也下降。

2.2不同生防菌處理液對臍橙炭疽GXA5-1孢子的抑制作用

從表2可以看出，在相同濃度下各生防菌對分生孢子萌發影響差異顯著，其中枯草芽孢桿菌在不同稀釋度下的相對抑制率都是最大的，而蘇云金芽孢桿菌的抑制效果不明顯，當稀釋度為10倍時蘇云金芽孢桿菌的抑制率為36.49%。相同生防菌菌株隨著濃度的下降對孢子萌發的抑制率也下降。

3討論

采用杯碟法測定枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、熒光假單孢菌、木霉菌、瓦克青霉、白淺灰鏈霉菌5種生防菌對菌株GXA5-1的抑制效果。試驗結果顯示白淺灰鏈霉菌抑制菌絲體生長的效果最顯著，在不同稀釋度下的相對抑制率都是最大的，稀釋10、100、200倍的相對抑制率分別為96.31%、85.82%、62.69%。枯草芽孢桿菌抑制孢子萌發的效果是最顯著的，稀釋10、100、200倍的相對抑制率分別為89.93%、67.59%、48.76%。

生防菌防治植物病害防效是植物體、病原菌和殺菌劑共同作用的結果，生防菌對臍橙炭疽病病原菌的生防機理呈多樣性，包括競爭作用、抑菌作用和誘導植物抗性等。在室內毒力測定中，主要是生防菌分泌抗菌物質抑制病原菌生長。如枯草芽孢桿菌產生抗菌素伊枯草素（iturin）能有效防治植物腐爛病，丁香假單胞桿菌產生丁香素防治檸檬綠霉病。當然防效是依靠多種機制協同作用，目前還沒有發現單一機制決定生物防效的生防菌。

本研究結果顯示，生防菌抑制率受有效濃度直接影響，隨著試驗濃度下降，抑制率也下降很快。而在大田生產中，生防菌有效濃度受陽光、氣溫、濕度及土壤營養條件等自然環境因素影響較大，因此生防菌的不穩定性成為目前生物農藥研發的最大阻礙。

雖然目前生防菌的防治機理研究不夠深入，在大田生產中對自然環境依賴性強故而導致對植物病害的防治效果不如化學藥物，但是從環境影響和安全的角度考慮，選育高效生防菌替代化學藥物防治植物病害是今后生物農藥開發的熱點。