正交試驗(yàn)優(yōu)化藍(lán)靛果忍冬組織培養(yǎng)條件

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摘要：以藍(lán)靛果忍冬組培苗為材料，采用正交試驗(yàn)對(duì)影響藍(lán)靛果忍冬分化、增殖、生根的因素進(jìn)行優(yōu)化篩選。結(jié)果表明，藍(lán)靛果忍冬分化的最優(yōu)組合為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA+30g/L蔗糖，分化率可達(dá)98.43%，各因素的影響程度為6-BA>NAA>蔗糖；增殖的最優(yōu)組合為MS+25g/L蔗糖+1.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA，增殖系數(shù)為3.81，各因素的影響程度為蔗糖>6-BA>NAA；生根的最適宜培養(yǎng)基為1/2 MS+0.5 mg/L IBA+1.0 mg/LNAA，生根率達(dá)100%、平均生根數(shù)5.29條、平均根長(zhǎng)1.45 cm，各因素的影響程度為IBA>基本培養(yǎng)基>NAA。

關(guān)鍵詞：藍(lán)靛果忍冬；正交試驗(yàn)；組織培養(yǎng)；分化；增殖；生根

中圖分類號(hào)：S663.904⁺3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002—1302（2016）01—0068—03

藍(lán)靛果忍冬（Lonicera edulis Turcz.）為忍冬科忍冬屬落葉灌木，別稱藍(lán)靛果、羊奶子、黑瞎子果、山茄子，主要分布于我國(guó)東北、華北、內(nèi)蒙古等地區(qū)，在俄羅斯、日本、朝鮮等國(guó)也有分布，是一種新興野生漿果資源。藍(lán)靛果忍冬富含氨基酸、維生素、礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素，營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值極高，可鮮食或加工為飲料、果酒、果醬、果糕。近年來，大量研究表明藍(lán)靛果忍冬的藥用價(jià)值很高，具有清熱解毒、穩(wěn)定血壓、改善肝臟、防止血管破裂、抗疲勞、抗腫瘤等功效。

正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)是確定最佳試驗(yàn)方案的有效方法，具有省時(shí)省力的優(yōu)點(diǎn)。我國(guó)自20世紀(jì)70年代將正交設(shè)計(jì)應(yīng)用于植物組織培養(yǎng)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于銀杏等多種植物的組織培養(yǎng)條件篩選中。藍(lán)靛果忍冬野生資源豐富，但其分布不均勻，并隨人類的大量采摘而日益減少。為使藍(lán)靛果忍冬得到廣泛應(yīng)用，大面積人工栽培開始興起，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)、組織培養(yǎng)技術(shù)選育優(yōu)良品種進(jìn)行工廠化育苗已成為發(fā)展趨勢(shì)。關(guān)于藍(lán)靛果忍冬組織培養(yǎng)的報(bào)道較多，而應(yīng)用正交試驗(yàn)法優(yōu)選藍(lán)靛果忍冬組織培養(yǎng)條件的研究則很少。本研究采用正交試驗(yàn)方法對(duì)藍(lán)靛果忍冬分化、增殖、生根培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化篩選，為藍(lán)靛果忍冬的種質(zhì)保存、工廠化育苗提供技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2014年3—11月在吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)園林生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，藍(lán)靛果忍冬組培苗由該實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1分化、增殖培養(yǎng)基篩選 本試驗(yàn)選用MS為基本培養(yǎng)基，以蔗糖、6-BA、NAA的質(zhì)量濃度為因素和水平，采用L₉（3⁴）正交表設(shè)計(jì)3因素3水平正交試驗(yàn)。剪取約2.0 cm的莖段，分別接種于各不同組合的培養(yǎng)基中。每個(gè)處理重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)接種8瓶，每瓶5個(gè)莖段。培養(yǎng)30 d后，分別統(tǒng)計(jì)分化率及增殖系數(shù)。分化率=分化苗莖段數(shù)/接種莖段數(shù)×100%；增殖系數(shù)=增殖后不定芽總數(shù)/接種不定芽總數(shù)。

1.2.2生根培養(yǎng)基篩選 利用L₉（3⁴）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)生根培養(yǎng)基，以基本培養(yǎng)基（1/4MS、1/2MS、3/4MS）、IBA（0.5、1.0、1.5 mg/L）、NAA（0.5、1.0、1.5 mg/L）為3個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè)置3個(gè)水平。將分化增殖培養(yǎng)獲得的健壯無菌苗切成3.0～3.5 cm的莖段，接種于上述培養(yǎng)基中。每個(gè)處理重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)接種8瓶，每瓶5個(gè)莖段。培養(yǎng)42 d后，統(tǒng)計(jì)生根率、平均生根數(shù)、平均根長(zhǎng)。生根率=生根莖段/接種莖段×100%；平均生根數(shù)（條）=總生根條數(shù)/接種莖段數(shù)；平均根長(zhǎng)（cm）=根長(zhǎng)總和/總生根條數(shù)。

上述培養(yǎng)基均添加瓊脂11 g/L、蔗糖25g/L（分化、增殖培養(yǎng)基除外），并將pH值調(diào)至5.8，于121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2.3培養(yǎng)條件 溫度（25±1）℃、光照時(shí)間12 h/d、光照強(qiáng)度2 500 k。

1.2.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 采用Excel 2010軟件、SPSS 17.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，采用SSR法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2結(jié)果與分析

2.1不同蔗糖及激素質(zhì)量濃度對(duì)藍(lán)靛果忍冬分化的影響

由表1可知，不同蔗糖及激素質(zhì)量濃度配比對(duì)藍(lán)靛果忍冬分化率的影響存在一定差異。其中組合5分化率最高為88.50%，組合1分化率最低為56.53%，兩者相差31.97%。就分化率而言，不同蔗糖、6-BA、NAA質(zhì)量濃度的極差（R）分別為9.17、17.52、11.21，表明各因素對(duì)藍(lán)靛果忍冬分化率影響的主次順序?yàn)?-BA質(zhì)量濃度>NAA質(zhì)量濃度>蔗糖質(zhì)量濃度，即6-BA質(zhì)量濃度對(duì)藍(lán)靛果忍冬分化率的影響最大，NAA質(zhì)量濃度次之，蔗糖質(zhì)量濃度的影響相對(duì)較小。各元素最優(yōu)水平為2.0 mg/L的6-BA、0.3 mg/L的NAA、30 g/L的蔗糖，因此可通過極差分析得到其分化的最優(yōu)組合為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA+30g/L蔗糖。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)是一種均一設(shè)計(jì)，不可能包含所有組合處理，因此該最優(yōu)組合并未在試驗(yàn)中得以顯示。經(jīng)后期試驗(yàn)驗(yàn)證，該組合分化率高于正交設(shè)計(jì)中所有其他組合，可達(dá)98.43%。由方差分析結(jié)果（表2）可知，各因素對(duì)分化率的影響差異極顯著（P<0.01）。根據(jù)F值大小（6-BA，24.203>NAA，11.509>蔗糖，8.091）分析，影響分化率的主要因素為6-BA質(zhì)量濃度，此結(jié)果與極差分析結(jié)果一致。

2.2不同蔗糖及激素質(zhì)量濃度配比對(duì)藍(lán)靛果忍冬增殖系數(shù)的影響

由表1可知，3種因素對(duì)藍(lán)靛果忍冬增殖系數(shù)的影響由大到小依次為蔗糖質(zhì)量濃度、6-BA質(zhì)量濃度、NAA質(zhì)量濃度，R值分別為1.21、0.86、0.70。可見，蔗糖質(zhì)量濃度對(duì)藍(lán)靛果忍冬增殖的影響最大。結(jié)合方差分析結(jié)果（表2）可知，藍(lán)靛果忍冬增殖的最佳組合為MS+25 g/L蔗糖+1.5 mg/L6-BA+0.3 mg/L NAA，為正交試驗(yàn)的處理5。該處理的增殖系數(shù)達(dá)3.81，與其他處理問差異極顯著，且該處理的藍(lán)靛果忍冬葉片多而深綠，植株高大健壯。

2.3不同基本培養(yǎng)基及激素質(zhì)量濃度配比對(duì)藍(lán)靛果忍冬生根的影響

在藍(lán)靛果忍冬生根培養(yǎng)過程中，不同培養(yǎng)基、不同激素配比組合對(duì)生根效果影響較大，生根率、平均生根數(shù)、平均根長(zhǎng)表現(xiàn)出不同變化規(guī)律（表3）。由各因素對(duì)藍(lán)靛果忍冬根系不同性狀影響的極差分析可知，對(duì)于生根率性狀而言，基本培養(yǎng)基極差為13.00，IBA極差為25.27，NAA極差為11.38；對(duì)于平均生根數(shù)而言，基本培養(yǎng)基極差為0.99，IBA極差為1.54，NAA極差為0.73；對(duì)于平均根長(zhǎng)而言，基本培養(yǎng)基極差為0.31，IBA極差為0.52，NAA極差為0.22。從生根率、平均生根數(shù)、平均根長(zhǎng)的情況來看，IBA質(zhì)量濃度均是決定藍(lán)靛果忍冬生根最重要的因素。可見，對(duì)于基本培養(yǎng)基均有k₂>k₁>k₃；對(duì)于IBA均有k₁>k₂>k₃；對(duì)于NAA均有k₂>k₃>k₁，方差分析結(jié)果（表4）表明各因素均達(dá)到顯著差異水平（P<0.05）。

由F值大小可知，各性狀均以IBA的F值最大，表明IBA質(zhì)量濃度是決定藍(lán)靛果忍冬生根最重要的因素，此結(jié)論與極差分析所得結(jié)論一致。在本試驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)，得到藍(lán)靛果忍冬生根的較優(yōu)組合為1/2 MS+0.5 mg/L IBA+1.0 mg/LNAA（處理4），此處理生根率高達(dá)100%、平均生根數(shù)5.29條、平均根長(zhǎng)1.45 cm，該處理所得藍(lán)靛果忍冬的根數(shù)多、根系粗壯、愈傷組織很少、組培苗生長(zhǎng)良好。

3結(jié)論

藍(lán)靛果忍冬分化的最適培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/LNAA+30 g/L蔗糖，分化率可達(dá)98.43%。由藍(lán)靛果忍冬的增殖情況可知，MS+25 g/L蔗糖+1.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA培養(yǎng)基的組培苗葉片多、植株高大健壯，增殖系數(shù)高達(dá)3.81，最適宜增殖。以1/2 MS+0.5 mg/L IBA+1.0 mg/L NAA為藍(lán)靛果忍冬的生根培養(yǎng)基，不僅根數(shù)多、根系粗壯，且很少產(chǎn)生愈傷組織，組培苗生長(zhǎng)良好。