深凹杯傘（Wtshyp2011001）的采集分離及液體優(yōu)化培養(yǎng)

郭素萍+趙金芬+楊槐俊

摘要：通過山西五臺山特殊菌株的采集分離與鑒定，得到一種具有重要研究價值的特殊菌株深凹杯傘，代號：Wtshyp2011001。利用液體發(fā)酵培養(yǎng)及培養(yǎng)基優(yōu)化篩選，得到一套深凹杯傘（Wtshyp2011001）菌株培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基配方及工藝條件，對該菌絲進(jìn)行粗多糖提取，為今后開展中試放大培養(yǎng)及藥效學(xué)研究提供了可靠數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞：深凹杯傘（Wtshyp2011001）；采集分離；液體優(yōu)化培養(yǎng)；特殊菌株；培養(yǎng)基配方 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

中圖分類號：R378 文章編號：1009-2374（2017）06-0026-02 DOI：10.13535/j.cnki.11-4406/n.2017.06.013

山西省菌類資源豐富，特別是五臺山蘑菇種類很多，是一種營養(yǎng)極高的食用菌類作物。主要品種有臺蘑小香蕈、銀盤蘑菇、雞腿菇、虎皮香蕈、秋露白等特殊菌種，具有很高的研究價值和經(jīng)濟(jì)價值，每年7月至9月是蘑菇采集的最佳季節(jié)。臺蘑的特點(diǎn)：肉質(zhì)細(xì)嫩，色澤乳白，菌體肥大，油性大，香味濃，可烹制成多種葷素名肴，是席上珍饈，五臺山南臺附近是主產(chǎn)地，出產(chǎn)的品質(zhì)也最佳。臺蘑除了有很高的營養(yǎng)價值之外，還有很好的醫(yī)療功效，長期食用可延年益壽，而且能產(chǎn)生對病毒的抗體，增加對感冒等病毒性疾病的抵抗力；還能起降低膽固醇，防止動脈硬化、腎臟病、膽結(jié)石、糖尿病、肝硬化等作用。我們通過五臺山特殊菌種采集、分離與鑒定，得到一種具有重要研究價值的特殊菌株深凹杯傘，代號：Wtshyp2011001。

1 特殊菌種的采集、分離、鑒定

2011年7月，我們在山西五臺山進(jìn)行了特殊蕈菌的采集、分離，海拔1600～2300米的落葉松的天然混交林中。

1.1 菌種采集、分離、純化過程

1.2 特殊菌種的分離、鑒定

我們對五臺山特殊真菌進(jìn)行了采集、收集、分離，共分離出8種特殊菌株。其中對采集分離到的特殊菌株（Wtshyp2011001）進(jìn)行了鑒定，結(jié)果如下：

菌株（Wtshyp2011001）ITS序列為95 ITS45，blast結(jié)果與Ampulloclitocybe clavipes（棒柄瓶杯傘）相似性為99%，與Infundibulicybe gibba（Clitocybe gibba，深凹杯傘）相似性為96%，但是下載另外幾條的Ampulloclitocybe clavipes ITS序列，相似性最高只有88%（見下圖），所以該菌株是否為Ampulloclitocybe clavipes還不能確定，需要其他的marker來確證。核糖體大亞基序列為95 LSU，blast結(jié)果與Infundibulicybe gibba相似性為99%，與Ampulloclitocybe clavipes相似性為93%。結(jié)合ITS和LSU的結(jié)果，基本認(rèn)為該種為Infundibulicybe gibba（Clitocybe gibba，深凹杯傘）。

表1主要對蔗糖3.0%，2.0%，1.0%；葡萄糖3.0%，2.0%，1.0%；牛肉膏1.5%，1.0%，0.5%；蛋白胨1.0%，0.5%，0%；磷酸鹽：KH2PO40.05%，K2HPO40.05%；KH2PO40%，K2HPO40.1%；KH2PO40.05%，K2HPO4 0%；NaNO3 0.1%，0.3%，0.5%進(jìn)行了考察，其他組分不變。

2.2 考察結(jié)果

用菌絲生長濃度作為對比參數(shù)。

培養(yǎng)條件：溫度22℃～24℃，時間8～10天，搖瓶裝量：100mL/250mL△瓶，搖瓶轉(zhuǎn)速180r.p.m。

2.2.1 碳源、氮源考察結(jié)果：

從表2實(shí)驗結(jié)果得出：選擇葡萄糖3.0%，牛肉膏0.5%，蛋白胨1.0%作為碳源、氮源較合理，且經(jīng)濟(jì)，菌絲生長快，菌絲相對濃度平均為42.4%。

2.2.2 磷酸鹽、無機(jī)鹽的考察結(jié)果：

從表2實(shí)驗結(jié)果得出：選擇NaNO30.3%作為無機(jī)鹽、K2HPO40.1%較合理，菌絲生長速度快，菌絲相對濃度平均為46.1%。從表1至表2培養(yǎng)基初步考察試驗結(jié)果，通過考察方差分析，確定了臺蘑深凹杯傘（Wtshyp2011001）最佳培養(yǎng)基配方以及培養(yǎng)工藝條件。葡萄糖3.0%，牛肉膏0.5%，蛋白胨1.0%，蠶蛹粉0.5%，NaNO3 0.3%，K2HPO4 0.1%，KCL 0.05%，F(xiàn)eSO4 0.001%，pH7.0。

2.3 深凹杯傘（Wtshyp2011001）液體培養(yǎng)溫度考察

在對分離的臺蘑深凹杯傘（Wtshyp2011001）進(jìn)行培養(yǎng)基篩選的同時，對培養(yǎng)溫度也進(jìn)行了考察，分三個溫度段：16℃～18℃、18℃～20℃、22℃～24℃，比較菌種生長濃度（見表3）。

表3溫度考察試驗得出：深凹杯傘（Wtshyp2011001）在培養(yǎng)溫度22℃～24℃培養(yǎng)，菌絲長勢最佳，菌絲濃度達(dá)到平均39.5%。

通過以上深凹杯傘（Wtshyp2011001）培養(yǎng)基配方考察試驗及溫度考察試驗，我們得出：深凹杯傘（Wtshyp2011001）最佳培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件：葡萄糖3.0%，牛肉膏0.5%，蛋白胨1.0%，蠶蛹粉0.5%，NaNO3 0.3%，K2HPO4 0.1%，KCL0.05%，F(xiàn)eSO4 0.001%，pH7.0。

培養(yǎng)條件：溫度22℃～24℃，時間8～10d，搖瓶裝量：100mL/250mL△瓶，搖瓶轉(zhuǎn)速180r.p.m。

臺蘑的生長與五臺山特殊的地理區(qū)域、氣候、植被以及牲畜活動密切相關(guān)。臺蘑粗蛋白含量高達(dá)41.84%，組成臺蘑蛋白質(zhì)的氨基酸種類齊全，尤其是人類必需的8種氨基酸更為豐富。臺蘑具有增強(qiáng)機(jī)體綜合免疫水平、抗腫瘤、預(yù)防和輔助治療心腦血管系統(tǒng)疾病以及調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、保肝護(hù)肝、鎮(zhèn)靜安神、潤肺祛痰等扶正壓邪的功效。

我們對采集分離的深凹杯傘（Wtshyp2011001）進(jìn)行了液體優(yōu)化培養(yǎng)，對其培養(yǎng)菌絲體進(jìn)行了有效成分粗多糖的提取，為今后開展藥效學(xué)研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

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基金項目：國家科技部國際科技合作項目“特殊蕈菌資源挖掘及評價利用的聯(lián)合研發(fā)”，項目編號：2014DFR31050。

作者簡介：郭素萍（1960-），女，山西康欣藥業(yè)有限公司教授級高級工程師，主持國家科技部國際科技合作項目“特殊蕈菌資源挖掘及評價利用的聯(lián)合研發(fā)”。

（責(zé)任編輯：黃銀芳）