冬棗花藥培養愈傷組織誘導的影響因素

段麗君　鄧青云　李國元　汪殿蓓

摘要：以冬棗花藥為試驗材料，探討冬棗花藥離體培養中不同麥芽糖濃度、不同激素濃度及低溫預處理和高溫預處理對花藥培養效果的影響，建立一套更適合冬棗花藥培養技術體系。結果表明：花藥膨大率與出愈率之間有明顯的相關性；在MS+2，4-D1.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+麥芽糖20/L+瓊脂4g/L培養基中最高花藥愈傷組織誘導率達37.2%，4℃低溫預處理3 d能顯著提高愈傷組織誘導率，35℃高溫預處理出愈率會顯著降低。

關鍵詞：冬棗；花藥培養；愈傷組織；誘導；技術體系；膨大率；出愈率；影響因素

中圖分類號：S665.104⁺.3 文獻標志碼：A

文章編號：1002—1302（2016）01—0060—03

冬棗（Ziziphusjujuba Mill.cv.Dongzao）為鼠李科棗屬植物，別稱果子棗、雁過紅、廟上福、蘋果棗、冰糖棗，果皮薄，核小，果肉汁多、細嫩酥脆、色澤鮮艷、甜味濃，富含鈣、鐵、鋅等多種礦物質，維生素C含量頗豐富，素有維生素C之王的稱號，其含糖量適中，味美可口，具有清理腸胃，有助于消化之功效，是美容和減肥的佳品。關于冬棗的花藥培養研究較少，王娜通過誘導胚胎愈傷組織的途徑對冬棗花藥進行培養，獲得1株單倍體植株；武曉紅研究了甘露醇、不同溫度條件預處理對棗花藥愈傷組織誘導的影響；劉曉光研究了冬棗花藥愈傷組織的誘導，懸浮系的建立、培養及愈傷懸浮系原生質體的分離。本試驗分析了麥芽糖、激素和低溫預處理等多種因素在冬棗花藥愈傷組織誘導中的作用，建立一套更適合冬棗花藥培養的技術體系，從而推動湖北省孝昌縣冬棗產業的快速發展。

1材料與方法

1.1試驗材料

冬棗花藥采自湖北省孝昌縣種植地。

1.2試驗方法

1.2.1愈傷組織的誘導 5—6月選取直徑為0.3～0.6 cm且花萼尚未張開的未成熟的新鮮花蕾，在70%乙醇中浸泡10 s，用無菌水沖洗3次，用0.1%氯化汞溶液浸泡10 min，再用無菌水沖洗3～4次，將花蕾轉移至已經滅過菌、鋪有濾紙的滅菌培養皿內，剝取花蕾，取出花藥，接種到盛有50 mL固體培養基的100 mL的三角瓶中，每瓶接種30枚，每個處理接種10瓶，放在（26±1）℃培養室黑暗條件下培養，觀察不同條件下花藥愈傷組織的誘導。

1.2.2繼代和分化培養 愈傷組織在培養基上生長一段時間后，營養物枯竭，水分散失，并已經積累了一些代謝產物，此時須要將這些組織轉移到新的培養基上，繼代培養基使用MS+6-BA 0.2 mg/L+2，4-D 0.2 mg/L+麥芽糖20 g/L+瓊脂4g/L。每次繼代培養約20 d，1～2次繼代后，挑選脆的胚性愈傷組織轉移至分化培養基MS+NAA 0.2 mg/L+麥芽糖20g/L+瓊脂4 g/L上。

2結果與分析

2.1花藥愈傷組織的誘導

花藥在誘導培養基上培養2 d后，局部開始發生褐變，4～5 d后大部分的花藥開始膨脹，出現不同程度的卷曲，花藥在2周后逐漸開裂，3周后在花藥花絲斷裂處和藥壁上長出愈傷組織或胚。從誘導的愈傷組織來看，大部分是淡黃色松散型（圖1），這種愈傷組織經過多次繼代培養，就更加松散，顆粒小，分散性很好，很難用鑷子夾起來，而且胚性細胞多，可較長時期保持其分化能力，分化頻率高。小部分是嫩綠色松散型（圖2），一般都是從花藥開裂處長出，分化頻率較低。

2.1.1麥芽糖濃度對冬棗花藥愈傷誘導率的影響 將消毒后的花藥分別接種在Ms培養基上，附加2，4-D 1.0 mg/L+6-BA 2.0 mg/L+瓊脂4 g/L進行試驗，由表1可以看出，冬棗花藥膨大率和誘導率有顯著影響。沒有麥芽糖的培養基里，愈傷組織誘導率非常低，只有3.7%；愈傷誘導率隨著麥芽糖濃度的提高而升高，當麥芽糖濃度達到20 g/L時，誘導率最高，為27.6%；當濃度達到30g/L時，會抑制愈傷組織的誘導。20 g/L麥芽糖產生的愈傷組織較好，呈黃綠色或黃色、塊狀、質地較硬、表面有顆粒狀突起。有利于形成胚性愈傷，當麥芽糖濃度高于20 g/L時，絕大部分的愈傷組織容易發生褐化死亡。

2.1.2激素對冬棗花藥愈傷誘導率的影響 將消毒后的花藥分別接種在Ms培養基上，附加麥芽糖20 g/L+瓊脂4 g/L進行不同濃度的激素組合試驗，由表2可以看出，花藥膨大率與愈傷組織誘導率成正比關系，在培養基中添加不同濃度的生長素和細胞分裂素誘導頻率不一樣。單獨使用1種細胞分裂素6-BA很難誘導出愈傷組織，只有同時添加生長素2，4-D和細胞分裂素6-BA才有利于花藥愈傷組織的產生，在6-BA濃度一定的情況下，隨著2，4-D濃度的升高，愈傷組織誘導率升高，而當濃度達到1.0 mg/L后呈下降趨勢，且2，4-D 1.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L培養基的愈傷誘導率最高，達37.2%。

2.1.3低溫預處理對冬棗花藥愈傷誘導率的影響 將冬棗的花蕾放人4℃冰箱中處理不同時間，將花藥接種在Ms+2，4-D 1.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+麥芽糖20 g/L+瓊脂4 g/L培養基上進行培養，50 d后觀察低溫預處理對愈傷誘導率的影響，結果見表3。4℃低溫預處理對花藥的愈傷誘導有顯著影響，預處理3 d愈傷誘導率達到46.6%，3 d后愈傷組織誘導率即顯著降低，且一直持續降低，由誘導后0 d的37.2%最終降為誘導后7 d的9.8%。

2.1.4高溫預處理對冬棗花藥愈傷誘導率的影響 將冬棗的花蕾放人35℃培養箱中處理不同時間，將花藥接種在Ms+2，4-D 1.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+麥芽糖20 g/L+瓊脂4 g/L培養基上進行培養，50 d后觀察高溫預處理對愈傷組織誘導率的影響，結果見表4。高溫預處理花藥的愈傷誘導率顯著降低，由誘導后0 d的37.2%最終降為誘導后7 d的3.7%。

2.2繼代培養和分化培養

把直徑為0.5 mm左右的愈傷組織放人繼代培養基后（圖3、圖4）再轉入分化培養基中，轉接2 d后愈傷組織體積慢慢增大，1周后愈傷組織局部變為綠色（圖5），2周后開始出現綠色的芽點，進一步分化成小幼苗。但大部分的愈傷組織多次分化后不能分化出小苗（圖6），開始衰敗，最后死亡（圖7、圖8）。

3結論與討論

在花藥培養中，糖是重要的碳源，主要功能是調節滲透壓。王娜等認為，20 g/L麥芽糖對冬棗花藥培養效果最好，愈傷誘導率高達57.81%。本試驗結果表明，高濃度的麥芽糖有利于愈傷誘導，但隨著麥芽糖濃度的增加，出愈率降低，愈傷組織生長量減少，這可能是增加培養中滲透壓的表現；激素的種類和濃度對愈傷組織的誘導非常重要，對大多數植物來說，如果不在基本培養基中添加激素，就不能誘導愈傷組織。一般細胞分裂素促進細胞質的分裂，生長素促進核的分裂（促進DNA合成），在脫分化培養基中，兩者共同使用對誘導愈傷組織十分重要，由于植物種類的不同，基因型決定其細胞分裂素與生長素的種類和濃度均有很大差異。在本試驗中，2，4-D 1.0 mg/L和6-BA 1.0 mg/L為最佳的激素組合，愈傷誘導率最高達37.2%。在棗的花藥培養過程中低溫預處理對啟動雄核發育發揮了重要的作用，有利于愈傷組織的誘導，這與武曉紅研究棗花藥培養中低溫預處理影響的結論一致。