加利福尼亞兔和新西蘭兔UCP1 基因第5外顯子多態(tài)性和生物信息學(xué)研究

李維　林家棟　劉若余　謝海強(qiáng)　李思　杜雪琴　肖超能

摘要：本試驗(yàn)以加利福尼亞兔和新西蘭兔為研究對(duì)象，分別用磁珠法動(dòng)物基因組DNA抽提試劑盒提取新西蘭兔和加利福尼亞兔的DNA，通過(guò)構(gòu)建DNA池，擴(kuò)增UCP1基因的第5外顯子及第4內(nèi)含子部分序列。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序，利用DNAStar和BLAST分析測(cè)序結(jié)果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在加利福尼亞兔中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)，在新西蘭兔中有4個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，分別為G743T、A744G、C819A和G849T，其中G743T為同義突變，A744G為錯(cuò)義突變，導(dǎo)致編碼的蘇氨酸（Thr）變?yōu)楸彼幔ˋla）；C819A、G849T突變位點(diǎn)位于內(nèi)含子區(qū)。多態(tài)位點(diǎn)的出現(xiàn)對(duì)UCP1基因的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的影響表現(xiàn)在其最小自由能由-1.93 MJ/mol變?yōu)?1.932 MJ/mol，同時(shí)SNPs位點(diǎn)對(duì)UCP1基因蛋白結(jié)構(gòu)也有一定影響。

關(guān)鍵詞：UCPl基因；新西蘭兔；加利福尼亞兔；SNPs；RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)

中圖分類號(hào)：S829.12 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002—1302（2016）01—0041—03

解偶聯(lián)蛋白（uneouplingprotein，UCPs）是褐色脂肪細(xì)胞線粒體內(nèi)膜上存在的一種質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它存在于動(dòng)物的各組織中，在能量平衡、維持體溫、機(jī)體產(chǎn)熱和代謝等方面都起著巨大的作用。比如，它激活后可以產(chǎn)生質(zhì)子電化學(xué)梯度降低，使呼吸鏈與ATP（三磷酸腺苷）合成過(guò)程解耦聯(lián)，使能量以熱的形式釋放；UCP1基因參與機(jī)體能量代謝，對(duì)機(jī)體能量平衡涉及的食物轉(zhuǎn)化效率、靜止代謝率和體重肥胖等性狀具有明顯的效應(yīng)，對(duì)肌肉生長(zhǎng)和品質(zhì)的改良作用重大。目前，這個(gè)家族的5種蛋白質(zhì)在魚(yú)、禽類、哺乳動(dòng)物甚至在人類的不同組織線粒體的內(nèi)膜上都已發(fā)現(xiàn)。其中，UCP1是最早發(fā)現(xiàn)的成員。

UCP1是褐色脂肪組織（brown adipose tissue，BAT）中表達(dá)的標(biāo)記基因，它具有解離氧化磷酸化耦聯(lián)功能，如機(jī)體通過(guò)在線粒體中產(chǎn)生能量，三羧酸循環(huán)產(chǎn)生的還原當(dāng)量通過(guò)電子將能量釋放，使H⁺從線粒體基質(zhì)轉(zhuǎn)移至內(nèi)膜面，形成1個(gè)跨線粒體內(nèi)膜的質(zhì)子電化學(xué)梯度，當(dāng)線粒體的ATP合酶將H⁺從內(nèi)膜面順梯度運(yùn)回至基質(zhì)面時(shí)，其能量可推動(dòng)二磷酸腺苷與磷酸結(jié)合，促使生成ATP。UCP1基因的表達(dá)增加可能是受到去甲腎上腺素促進(jìn)，使其與G偶聯(lián)蛋白相關(guān)的環(huán)磷酸腺苷合成，后者又可使蛋白激酶激活，蛋白激酶作用的靶蛋白包括激素敏感性脂肪酶，這種酶一旦被磷酸化激活就可以抑制三酰甘油的貯存，使脂肪分解，非脂化脂肪酸增加，促進(jìn)產(chǎn)熱作用。此外，UCP1表達(dá)增加還有可能受腎上腺素和甲狀腺素等的刺激，從而增加棕色脂肪組織所消耗脂肪酸的活性，因此UCPl被認(rèn)為是2型糖尿病和抵抗肥胖的重要基因。

Clark等發(fā)現(xiàn)，UCP1基因的表達(dá)水平對(duì)羔羊出生后的成活率起著重大作用。Bassett等發(fā)現(xiàn)，UCP1基因的表達(dá)對(duì)初生羔羊BAT的含量影響重大。然而對(duì)兔線粒體中UCP1基因方面的研究很少，本試驗(yàn)以加利福尼亞兔和新西蘭兔構(gòu)建其DNA池，對(duì)UCP1基因第5外顯子及第4內(nèi)含子部分序列進(jìn)行擴(kuò)增，BLAST分析其測(cè)序結(jié)果篩選多態(tài)位點(diǎn)，由DNAStar軟件進(jìn)行序列拼接、校正，并預(yù)測(cè)其對(duì)RNA結(jié)構(gòu)影響和等位基因頻率估算。

1材料與方法

1.1樣品的來(lái)源

從貴州貴陽(yáng)白云牛場(chǎng)大林農(nóng)牧專業(yè)合作社種兔場(chǎng)和貴州貴陽(yáng)修文盛鑫兔業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司種兔場(chǎng)采取加利福尼亞兔的組織樣48個(gè)和新西蘭兔組織樣48個(gè)，將采取的樣品放在已編好序號(hào)的自封袋中于-20℃冰箱中保存。

1.2構(gòu)建DNA池和引物設(shè)計(jì)、合成

利用磁珠法動(dòng)物基因組（組織）DNA抽提試劑盒提取DNA，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提的DNA，取5μL構(gòu)建DNA池。以兔UCPl基因（其GenBank登錄號(hào)為：NC_013683.1）DNA序列利用Primer-BLAST設(shè)計(jì)1對(duì)引物來(lái)擴(kuò)增UCPl基因第5外顯子和第4內(nèi)含子的部分序列，將所設(shè)計(jì)的引物送往生工生物工程（上海）股份有限公司合成。物序列為F：GAGGTAAGTCCATCCCCACG，R：ACTCTTCTA-ACGATGTAGTGTC；退火溫度為59℃；目的片段大小為809 bp。

1.3 DNA的擴(kuò)增和序列的分析

反應(yīng)體系為25μL：2×Taq PCR Master Mix試劑12.5μL，基因組DNA 2.5μL，三蒸水7μL，上、下游引物10 pmol/μL各1.5μL。PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，并用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，最后拍照保存。

將擴(kuò)增的產(chǎn)物送往立菲生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。用DNAStar軟件校正測(cè)序結(jié)果，通過(guò)BLAST軟件對(duì)SNPs進(jìn)行確定。

1.4測(cè)量峰高及等位基因頻率估算

利用MWSnap軟件對(duì)SNP位點(diǎn)等位基因的相應(yīng)峰高進(jìn)行測(cè)量，可依據(jù)如下公式f_i=h_i/（h₁+h₂），i=1，2，對(duì)等位基因頻率進(jìn)行估算。f_i表示SNP位點(diǎn)某等位基因頻率，h₁表示SNP等位基因1峰的高度，h₂表示SNP等位基因2峰的高度。

1.5 RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

通過(guò)在線預(yù)測(cè)軟件：http：∥rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi，對(duì)UCPl基因突變前后不同DNA序列進(jìn)行RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)變化的預(yù)測(cè)，通過(guò)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)在線預(yù)測(cè)軟件：https：∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html，對(duì)UCPl基因突變前后不同蛋白氨基酸序列進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

2結(jié)果與分析

2.1 PCR產(chǎn)物擴(kuò)增

設(shè)計(jì)1對(duì)引物分別擴(kuò)增加利福尼亞兔和新西蘭兔的UCPl基因第5外顯子及第4內(nèi)含子部分序列。PCR擴(kuò)增（圖1）后送往立菲生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，BLAST分析共發(fā)現(xiàn)4個(gè)SNPs（圖2）。NCBI中SNP數(shù)據(jù)庫(kù)尚無(wú)該基因SNP信息，本試驗(yàn)所篩查的SNPs均為新發(fā)現(xiàn)多態(tài)性位點(diǎn)，以UCP1基因第1外顯子第1位為+1位，SNPs位點(diǎn)分別為G743T、A744G、C819A、G849T，其中G743T為同義突變，A744G為錯(cuò)義突變，導(dǎo)致編碼的蘇氨酸（Thr）變?yōu)楸彼幔ˋla）；C819A、G849T突變位點(diǎn)位于內(nèi)含子區(qū)。

2.2估算SNPs等位基因頻率

通過(guò)MWSnap軟件對(duì)加利福尼亞兔和新西蘭兔SNPs等位基因峰高進(jìn)行測(cè)量，根據(jù)公式估算4個(gè)SNPs位點(diǎn)等位基因頻率（表1）。由表1可知，內(nèi)含子C819A和外顯子A744G在加利福尼亞兔和新西蘭兔中有較大差異，而外顯子G743T和內(nèi)含子G849T在2種兔品種中差異較小，且加利福尼亞兔的4個(gè)位點(diǎn)基因頻率均高于新西蘭兔。

2.3預(yù)測(cè)UCP1基因的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)

預(yù)測(cè)突變前后UCP1基因的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，SNPs導(dǎo)致RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，并導(dǎo)致RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)最小自由能發(fā)生變化，由-1.934 MJ/mol變?yōu)?1.932 MJ/mol，這不僅可能影響RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，還可能影響后續(xù)蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程（圖3）。

2.4突變前后UCP1蛋白二級(jí)的預(yù)測(cè)

通過(guò)在線SOPMA服務(wù)器預(yù)測(cè)新西蘭兔UCP1基因突變前后蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果表明：突變前后α螺旋由109變到110，而B(niǎo)轉(zhuǎn)角由39變成40，延伸鏈由86變到83，自由卷曲由72變到73（表2）。

3討論

大量的研究表明，UCP基因家族與畜禽肉質(zhì)關(guān)系密切。涂榮劍等對(duì)豬的UCP3基因研究發(fā)現(xiàn)，突變可能導(dǎo)致相應(yīng)編碼氨基酸序列的改變，從而影響胴體、肉質(zhì)性狀。韓瑞華等對(duì)牛的UCP3基因進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)UCP3基因不僅對(duì)肉牛胴體、肉質(zhì)性狀等方面具有重要影響，而且對(duì)肉牛的育種工作具有指導(dǎo)作用。王濤等研究了UCP基因?qū)﹄u肉質(zhì)和豬肉質(zhì)量的影響。肌內(nèi)脂肪沉積是兔肉肉質(zhì)標(biāo)記輔助選擇中重要的選擇指標(biāo)，篩選出對(duì)家兔肌內(nèi)脂肪沉積有影響的基因有助于加快品種選育進(jìn)程和提高家兔肉質(zhì)性能。

目前對(duì)兔的UCP1基因多態(tài)性研究報(bào)道很少，本試驗(yàn)以加利福尼亞兔和新西蘭兔為研究，對(duì)UCP1基因第5外顯子及第4內(nèi)含子部分序列進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4個(gè)新的多態(tài)性位點(diǎn)：G743T、A744G、C819A、G849T，其中G743T為同義突變，A744G為錯(cuò)義突變，導(dǎo)致編碼的蘇氨酸（Thr）變?yōu)楸彼幔ˋla）；C819A、G849T突變位點(diǎn)位于內(nèi)含子區(qū)。比較加利福尼亞兔和新西蘭兔多態(tài)性位點(diǎn)等位基因頻率發(fā)現(xiàn)，內(nèi)含子C819A和外顯子A744G在加利福尼亞兔和新西蘭兔中有較大差異，而外顯子G743T和內(nèi)含子G849T在2個(gè)兔品種中差異較小，且加利福尼亞兔的4個(gè)位點(diǎn)基因頻率均高于新西蘭兔。

突變前后UCP1編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)也發(fā)生了改變，B轉(zhuǎn)角由39變成40，α螺旋由109變到110，延伸鏈由86變到83，自由卷曲由72變到73。突變前后UCPl基因RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，其最小自由能由-1.934 MJ/mol變?yōu)?1.932 MJ/mol。這說(shuō)明該位點(diǎn)可能影響2個(gè)品種的肌內(nèi)脂肪沉積等肉質(zhì)性狀差異，下一步工作將分析該多態(tài)性位點(diǎn)與兔肌內(nèi)脂肪沉積性狀的關(guān)聯(lián)性，就UCP1基因?qū)ν萌赓|(zhì)性能的調(diào)控作進(jìn)一步探究，從而為線粒體中相關(guān)基因?qū)ν眉?nèi)脂肪沉積影響提供一定的依據(jù)。