單一情緒刺激與復(fù)合情緒刺激對肝郁證動物模型作用的比較

石 亮，孫佳惠，孫 蓉

(1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355；2. 山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟(jì)南 250014；3. 中國海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院，教育部海洋藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島 266003)

研究報(bào)告

單一情緒刺激與復(fù)合情緒刺激對肝郁證動物模型作用的比較

石 亮1，孫佳惠3，孫 蓉2

(1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355；2. 山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟(jì)南 250014；3. 中國海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院，教育部海洋藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島 266003)

目的 比較單一情緒刺激與復(fù)合情緒刺激對肝郁證動物模型的影響，以期篩選出一種更加貼近臨床肝郁證候表現(xiàn)的造模方法。方法 通過前期篩選，分別建立夾尾法，四肢捆綁法和頸部帶枷法的單一造模模型和三種方法復(fù)合造模的模型。建立肝郁證人與大鼠證候?qū)φ毡硪约案斡糇C大鼠證候賦分表，結(jié)合中醫(yī)證候指標(biāo)、一般觀察、體重指標(biāo)、陽性藥物反證以及體內(nèi)激素指標(biāo)的測定，以驗(yàn)證造模結(jié)果。 結(jié)果 正常組大鼠生長狀況良好；模型組大鼠主要表現(xiàn)為急性應(yīng)激躁狂和慢性應(yīng)激抑郁，糞便干、少、小，多數(shù)出現(xiàn)眼睛暗紅、脫毛、呼吸急促的癥狀，大鼠體重增長率降低，下丘腦CRH水平、血漿CORT、ACTH水平與正常對照組相比顯著升高，且復(fù)合造模組成模效果效果明顯優(yōu)于單一造模組；陽性藥物組經(jīng)藥物治療后其癥狀明顯好轉(zhuǎn)，各指標(biāo)也趨近正常組。結(jié)論 使用夾尾、四肢捆綁和頸部帶枷復(fù)合情志造模法構(gòu)建肝郁證大鼠模型周期短、穩(wěn)定性好、成功率高，模型動物表現(xiàn)與臨床肝郁證證候有較高的一致性。

情緒刺激，肝郁證，大鼠模型

肝郁證是我國傳統(tǒng)中醫(yī)診斷中較為常見的證候之一。近年來，為了探討肝郁證的實(shí)質(zhì)，為更好地臨床實(shí)踐提供理論依據(jù)，深化中醫(yī)客觀化研究，將中醫(yī)客觀化研究進(jìn)一步深入到傳統(tǒng)中醫(yī)理論，解決中西醫(yī)脫節(jié)的問題，國內(nèi)各位專家學(xué)者對肝郁證的發(fā)病機(jī)理、用藥機(jī)理等進(jìn)行了大量的研究，并取得了較大的進(jìn)展。自1971年開始，肝郁證研究進(jìn)入模擬醫(yī)學(xué)動物模型階段。

肝郁證動物模型的復(fù)制，是圍繞肝郁證的一系列實(shí)驗(yàn)成敗與否的關(guān)鍵所在，探究符合中醫(yī)理論又具備可實(shí)施性的造模方法，并建立科學(xué)的模型評價(jià)體系是至關(guān)重要的[1]。但如何從中醫(yī)理論的角度，使用科學(xué)恰當(dāng)?shù)姆椒ń⑦m宜于中藥活性評價(jià)的肝郁證模型，這種方法要具備一定的可行性、穩(wěn)定性與較好的重復(fù)性，如何尋求合適的指標(biāo)對模型進(jìn)行評價(jià)，這種指標(biāo)要具備嚴(yán)謹(jǐn)性與特異性，以上兩點(diǎn)，一直以來都是眾多學(xué)者研究的重點(diǎn)與難點(diǎn)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

Wistar大鼠，雄性，體重(180～220)g，適齡、健康。購于山東大學(xué)動物中心，生產(chǎn)許可證證號：SCXK(魯)20130009。

實(shí)驗(yàn)動物飼料(鼠)，許可證號：SCXK(魯)20130014。動物使用許可證號：SYXK(魯) 20130001。1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

柴胡舒肝丸(藥都制藥股份有限公司，批號：141101)。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

試劑CORT、CRH、ACTH檢測試劑盒，均購于南京建成生物研究所，批號：20141231

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

自制頸部枷：鋁片拼合到一起構(gòu)成外圍呈5 cm × 5 cm的正方形，中間為半徑1.5 cm的圓形，側(cè)邊可開合以便于調(diào)節(jié)大小，如圖1所示。鑷子：用紗布包纏鑷子尖端，精密電子天平(梅特勒·托利多有限公司)，DDL-5型低速冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，UV-2102型紫外分光光度儀(中美合資尤尼柯有限公司)，F(xiàn)-820血液分析儀裝置(ABXmicos 60)，HH-S恒溫水浴鍋(江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠)。

圖1 頸部枷Fig.1 Picture of the neck cangue

2 實(shí)驗(yàn)方法

將大鼠隨機(jī)分為9組，每組10只，分別為空白對照組，捆綁造模組，捆綁造模陽性藥物組，帶枷造模組，帶枷造模陽性藥物組，夾尾造模組，夾尾造模陽性藥物組，復(fù)合情志造模組，復(fù)合情志造模陽性藥物組。

捆綁造模組：每日用繃帶捆綁大鼠四肢影響其正常行走，大鼠屬于夜晚活動較多的物種，因此每日下午五點(diǎn)捆綁，經(jīng)1夜后第2天早上八點(diǎn)取下。

帶枷造模組：根據(jù)購進(jìn)大鼠的體型，設(shè)計(jì)并委托商家制作了一批鋁制枷鎖，兩片鋁片拼合到一起構(gòu)成外圍呈5 cm × 5 cm的正方形，中間為半徑1.5 cm的圓形，側(cè)邊可開合以便于調(diào)節(jié)大小。每日為老鼠帶枷，前5日白天帶枷，并且隨著造模時(shí)間的推進(jìn)逐漸增加帶枷時(shí)間，從第6日開始整夜帶枷，以期更大程度地影響大鼠的日常行為從而取得更好的造模效果。

夾尾造模組：每日使用用紗布包纏過的鑷子來回?cái)?shù)次夾大鼠的尾巴，力度以不對老鼠造成傷害為前提，令老鼠感到郁怒不適而不得發(fā)。

復(fù)合情志造模組：每日白天為老鼠帶枷，隨著造模時(shí)間的推進(jìn)逐漸增加帶枷時(shí)間，到造模后期改為整晚帶枷。每天晚上用繃帶細(xì)條束縛大鼠雙后肢，使其行走困難、活動受限。另外，配合夾尾法，每日使用用紗布包纏過的鑷子來回?cái)?shù)次夾大鼠的尾巴，力度以不對老鼠造成傷害為前提，令老鼠感到郁怒不適而不得發(fā)。

對捆綁造模陽性藥物組，帶枷造模陽性藥物組，夾尾造模陽性藥物組和復(fù)合情志造模陽性藥物組，每日按照臨床等效量的二倍量3.6 g/kg給藥。

3 評價(jià)方法

3.1 中醫(yī)證候指標(biāo)

我們將人體肝郁主次證候與大鼠的表現(xiàn)進(jìn)行了對應(yīng)(表1)，采用分級賦分的方法，以中醫(yī)主次證對應(yīng)大鼠的表現(xiàn)為依據(jù)，制定了肝郁證模型證候指標(biāo)賦分表(表2)

根據(jù)賦分表指標(biāo)，每兩天對大鼠的精神狀態(tài)、呼吸、尾部瘀斑、毛發(fā)、眼睛、眼周、糞便等進(jìn)行觀察，分別賦分并記錄，最后計(jì)算出每只大鼠的總積分，并對各組之間進(jìn)行t檢驗(yàn)看是否存在顯著性差異。

3.2 體重指標(biāo)

每兩日對大鼠進(jìn)行一次稱重，記錄體重變化，并對各組大鼠的體重變化率進(jìn)行比較。

3.3 體液指標(biāo)

根據(jù)近年來國內(nèi)外學(xué)者的研究結(jié)果，肝郁證大鼠體內(nèi)下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素(CRH)、血漿促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)和皮質(zhì)酮(CORT)水平相較于正常大鼠有較為明顯的變化[2]，因此我們選取此三項(xiàng)指標(biāo)對大鼠進(jìn)行測定，從而對造模結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

兩周造模后，對大鼠進(jìn)行眼球取血，4℃ 3 000 r/min離心10 min后取上清液備用，-20℃以下進(jìn)行保存，待測ACTH、CORT；另快速剖取大鼠腦組織，置入沸騰的0.85%氯化鈉溶液中煮5 min，然后分離下丘腦，稱重之后放在玻璃勻漿管中，再加入1 mol/L HCl 1 mL，進(jìn)行充分勻漿，倒入塑料指形管，室溫放置100 min以使生物肽充分溶解于酸中，加入1 mol/L NaOH 0.8 mL以中和酸，最后以4 000 r/min離心10 min，取上清液后-20℃保存，待測CRH。最后按照免疫試劑盒上的規(guī)定要求使用放射免疫法進(jìn)行測定。

3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

表1 人體-大鼠肝郁證診療標(biāo)準(zhǔn)對照表

表2 適用于肝郁證模型大鼠證候積分評價(jià)量表

圖2 第14天各組大鼠中醫(yī)證侯總積分Fig.2 The total scores of TCM Syndromes of the D14 rats

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1 中醫(yī)證候賦分

由圖2可看出，造模第14天復(fù)合造模組總證候積分明顯高于其他組，且與復(fù)合造模陽性藥組差別明顯，另外，三種單一情志造模法中，捆綁造模組積分最高，其次是帶枷組，最后是夾尾組，但捆綁陽性藥組積分并無明顯下降，證明捆綁造模所形成的證候可能并不是很符合肝郁證。

由圖3可看出，復(fù)合造模組總證候積分在第4天開始即明顯高于其他各組，且增長迅速，而其他三組證候積分增長相對較為平緩。另外，復(fù)合造模組組證候積分到后期趨于平緩，證明其具有一定的穩(wěn)定性。此圖說明復(fù)合情志造模法周期短、肝郁證癥狀顯著、穩(wěn)定性好的優(yōu)勢。圖4 各組大鼠體重變化情況

4.2 體重

由圖4可看出:(1)復(fù)合模型組體重變化率從第四日開始就明顯低于其他各組，而其他三種單一情志造模組僅略低于正常對照組，證明復(fù)合情志造模法造模周期短，效果較好；(2)復(fù)合造模陽性藥物組體重變化率高于復(fù)合造模組，證明造模結(jié)果與肝郁證證候相符合；(3)在三種單一情志造模法中帶枷造模組的體重變化率最低，且?guī)Ъ详栃运幗M體重變化率有所提高，證明三種方法中帶枷法造模效果最好。(4)夾尾造模組與夾尾陽性藥組的體重變化率差別不大，證明所用陽性藥并不能很好地對模型證候進(jìn)行治療，即夾尾法并不能很好地復(fù)制肝郁證模型。

4.3 相關(guān)指標(biāo)

使用放射免疫法對下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素(CRH)、血漿促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)和皮質(zhì)酮(CORT)進(jìn)行測定，結(jié)果如表3所示。

由表3可以看出，復(fù)合情志造模組的CRH、ACTH、CORT的水平較空白對照組均差異有非常顯著性，這表明模型組大鼠處于交感神經(jīng)系統(tǒng)較為亢奮的狀態(tài)，這與臨床中肝郁證患者的植物神經(jīng)功能檢查結(jié)果也是一致的。另外，復(fù)合情志造模陽性藥物組與復(fù)合情志造模組的CRH、ACTH、CORT水平同樣具有非常顯著性差異，這證明陽性藥物對于動物模型的癥狀是有治療作用的。

5 討論

中醫(yī)認(rèn)為抑郁是情志內(nèi)傷導(dǎo)致肝氣郁結(jié)，進(jìn)而引起臟腑氣機(jī)失調(diào)所致，以情志抑郁、胸脅或少腹脹痛等為辨證的主要依據(jù)。肝郁證候臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)中的證候條目包括：(1)肝經(jīng)所過部位經(jīng)氣阻滯引起的癥狀：包括脅肋脹痛或竄痛，乳房、或少腹脹滿疼痛，胸悶，善太息等；(2)情志失常，主要表現(xiàn)為精神抑郁，煩躁易怒；(3)咽部異物感，或頸部癭瘤、瘰疬，或脅下腫塊，病情輕重與情緒變化的關(guān)系密切。

圖3 各組大鼠中醫(yī)證侯總積分變化趨勢Fig.3 The change trend of total scores of TCM syndrome in the rats

圖4 各組大鼠體重變化情況Fig.4 Changes of body weight in rats in the each group

組別Groups下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素CRH(pg/mL)血漿促腎上腺皮質(zhì)激素ACTH(pg/mL)皮質(zhì)酮CORT(pg/mL)空白對照組Blankcontrolgroup25.8±4.523.6±2.37.9±1.5捆綁造模組Bindingmodel30.7±4.0*30.5±3.9***13.3±2.3***捆綁造模陽性藥物組Bindingmodelpluspositivedruggroup29.4±2.2*25.5±2.39.6±2.0帶枷造模組Neckcanguemodel33.0±2.6***27.4±2.9**12.7±2.6***帶枷造模陽性藥物組Neckcangueandpositivedrugmodelgroup27.7±3.024.1±2.99.9±1.7**夾尾造模組Tailclampingmodel29.3±1.4*30.7±3.6***13.7±2.2***夾尾造模陽性藥物組Tailclampingandpositivedrugmodelgroup28.8±2.027.0±3.6*9.8±1.7**復(fù)合情志造模組Compoundemotionalstimulationmodel39.8±4.3***36.3±3.5***18.5±2.5***復(fù)合情志造模陽性藥物組Compoundemotionalstimulationandpositivedrugmodelgroup27.3±2.726.6±2.3*9.7±2.7

注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001.

Note. Compared with the blank control group,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.

目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為肝郁證是負(fù)性情緒心理應(yīng)激狀態(tài)下神經(jīng)中樞調(diào)節(jié)機(jī)制發(fā)生紊亂而導(dǎo)致的多系統(tǒng)病理改變[3]，其發(fā)病機(jī)制與HPA軸功能亢進(jìn)密切相關(guān)；持續(xù)應(yīng)激狀態(tài)使下丘腦-垂體-腎上腺軸強(qiáng)烈興奮，下丘腦合成和分泌CRH增多，刺激垂體合成分泌更多的ACTH，促進(jìn)腎上腺分泌糖皮質(zhì)激素GC增多，GC與海馬內(nèi)糖皮質(zhì)激素受體(GR)結(jié)合造成海馬及藍(lán)斑等處損傷，導(dǎo)致情緒低落、困倦乏力、興趣喪失等[4]；長期應(yīng)激狀態(tài)使HPA軸持續(xù)亢進(jìn)，將嚴(yán)重影響人體身心健康、導(dǎo)致抑郁癥癥狀[5]。柴胡舒肝丸具有具有疏肝理氣，消脹止痛之功效，為治療肝郁證要藥，可改善CRH、ACTH、CORT水平，說明本模型與臨床證候吻合度較好。

中醫(yī)認(rèn)為肝與情志的關(guān)系最為密切，并在心理應(yīng)激調(diào)節(jié)中起著決定作用[6]，臨床上將慢性心理應(yīng)激相關(guān)疾病歸屬于中醫(yī)“郁證”的范疇，基本治則為疏肝理氣解郁[7]，慢性應(yīng)激刺激造模法也常被用作抑郁癥動物模型和中醫(yī)肝郁證動物模型制備[8-10]。由于肝郁證臨床病因病機(jī)復(fù)雜，因此，單一情緒刺激造模法不能與臨床實(shí)際相吻合，不能準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)藥物活性和開展藥效評價(jià)。本實(shí)驗(yàn)從中醫(yī)肝郁證病因病機(jī)為指導(dǎo)，臨床表現(xiàn)為背景，提出肝郁證動物模型評價(jià)指標(biāo)構(gòu)成，通過證候賦分、體重、體液指標(biāo)、陽性藥反證等一系列評價(jià)技術(shù)，驗(yàn)證模型的成功率，發(fā)現(xiàn)模型具有成模時(shí)間短、與臨床證候吻合度高、可行性好，證候表現(xiàn)穩(wěn)定的特點(diǎn)，為進(jìn)一步探討肝郁證的本質(zhì)，開展疏肝解郁中藥的創(chuàng)新藥發(fā)現(xiàn)提供實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀τ趶?fù)合因素造模條件及各個(gè)條件參數(shù)變化對成模的影響及動物因素對模型的干擾等問題，還值得我們進(jìn)一步深入探討。

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Comparison of the effects of single emotional stimulus and complex emotional stimuli on the rat model of liver depression syndrome

SHI Liang1,SUN Jia-hui3, SUN Rong2

(1. Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China;2. Shandong Academy of Chinese Medicine, Jinan 250014;3. School of Medicine and Pharmacy, Ocean University of China; Key Laboratory of Marine Drugs，Ministry of Education. Qingdao 266003 )

Objective To compare the effects of single and complex emotional stimuli on animal model of liver depression syndrome, in order to find out an animal model of liver depression syndrome with more similar clinical manifestations. Methods Based on the previous screening work, different methods, i.e. tail clamping, limb binding, putting a cangue on the neck, were used respectively, or using the three methods in combination to establish rat models of liver depression syndrome. A comparison table of human and rat liver depression syndrome was prepared, a mark sheet of evaluation criteria was made, general condition was observed and body weight was measured, and positive response to drugs and changes of hormonal levels were evaluated to identify whether the models were established successfully. Results Rats in the control group grew well and showed no abnormalities. There were lots of abnormal phenomena in the model group especially in the complex emotional stimulus modeling group. They were maniac with acute stress or depressive with chronic stress, had dry hair, small and less feces, many of the rats had hair loss, red eyes and shortness of breath symptom. They showed a significantly lower body weight gain and higher levels of CRH in hypothalamus and plasma ACTH and CORT. The manifestations were much more severe in the complex-emotional stimuli-induced model group than that in the single-stimulus prepared model groups. The drug-treated group showed considerable alleviation of the symptoms and improvement of the parameters closing to normal levels.Conclutions Establishing the rat model of stagnation of liver depression syndrome by complex emotional stimuli modeling method has good stability, with a short preparation period and high success rate, and presenting a better consistence with clinical liver stagnation of depression syndrome, so as to provide a suitable tool for TCM research.

Emotional stimulus; Liver stagnation; Depression syndrome; Rat model

國家重大新藥創(chuàng)制重大專項(xiàng)課題：中藥復(fù)方藥理學(xué)研究與藥效評價(jià)關(guān)鍵技術(shù)(2009ZX09502-015)；山東省自主創(chuàng)新和成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目(2014ZZCX02104)；國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81374059)； 泰山學(xué)者工程專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助(Ns201511107)。

石亮，男，在讀碩士研究生，中藥藥理學(xué)專業(yè)，Tel:15562459772，Email: shiliangbest@163.com。

孫蓉，女，研究員，博導(dǎo)，研究方向：中藥藥理與毒理，Tel: 0531-82949849，Email: sunrong107@163.com。

R-33

A

1671-7856(2017) 04-0082-07

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.04.014

2017-01-11