Shkbp1缺失對小鼠 T淋巴細胞系亞群的影響

劉 擎，張瀟涵，仰明明，周澤啟，王麗京，李江超

(廣東藥科大學 基礎學院血管生物學研究所，廣州 510006)

研究報告

Shkbp1缺失對小鼠 T淋巴細胞系亞群的影響

劉 擎，張瀟涵，仰明明，周澤啟，王麗京，李江超

(廣東藥科大學 基礎學院血管生物學研究所，廣州 510006)

目的 探討Shkbp1缺失小鼠(Shkbp-1-/-)的血液、骨髓、脾臟中血液細胞分類和T細胞亞群的變化。方法 采用Shkbp-1-/-轉基因小鼠，經PCR 鑒定基因型；利用全自動血液檢測儀測定血液細胞分類；采用流式細胞儀檢測Shkbp-1-/-和對照組小鼠血液、骨髓、和脾臟中T 淋巴細胞亞群。結果 血常規結果：中性粒細胞和嗜酸性粒細胞有增高趨勢，且有顯著差異。淋巴細胞未見顯著差異。流式結果顯示：對照組血液中CD4+CD8+雙陽性細胞降低，骨髓中CD3+、CD4+升高。 但脾臟組織中，其CD3+、CD4+、CD8+、CD4+CD8+雙陽性細胞均呈下降趨勢。結論 Shkbp1參與血液細胞的成熟分化，影響了免疫細胞數量，本研究為探索Shkbp1如何參與血液細胞的分化奠定了研究基礎。

Shkbp-1； T細胞亞群；CD3+；CD4+；CD8+；基因工程小鼠

Shkbp1基因于2008年通過酵母雙雜交的方法被篩選出來[1]，研究表明Shkbp1蛋白存在兩個富含脯氨酸(PXXXPR)的結構域第618～623位氨基酸殘基(PSPSPR)和第679-684位氨基酸殘基(PTRApR)參與CIN85的SH3保守結構域結合[2，3]。Shkbp1可以競爭抑制CIN85和c-Cbl的結合,從而阻斷表皮生長因子受體(EGFR)的內吞和降解。Cbl是一種泛素化激酶，有c-Cbl，Cbl-b和Cbl-3三個成員組成。c-Cbl它能夠與酪氨酸激酶和受體酪氨酸激酶結合并被磷酸化，磷酸化后的c-Cbl泛素化激酶活性被激活，使與其結合的酪氨酸激酶和受體酪氨酸激酶多聚泛素化降解[4]。

一般情況下，受體活化并傳遞信號后就會從細胞表面脫落，以避免信號持續活化對有機體產生傷害。當受體酪氨酸激酶活化后的負調控被阻斷或者擾亂后，細胞功能異常，人體就會產生惡性腫瘤等疾病[5]。EGF(表皮生長因子)和EGFR結合，二聚化后自身磷酸化的EFGR與c-cbl(泛素化激酶)通過SH2保守結構域結合并使之磷酸化，激活泛素酶活性使EGFR一部分降解[6-8]。其次，Shkbp1被報道與遺傳疾病相關，還有報道其與卵巢癌[9]和白血病[10]相關。

Shkbp1參與血細胞起源、增殖、分化和發育成熟的過程。血細胞在造血器官或組織中產生，發育成熟或接近成熟時才釋放到血液中，但是該基因的缺失是否能引起小鼠血液細胞分化和免疫細胞的改變，并未見報道。本研究針對Shkbp1基因缺失小鼠，檢測其免疫功能的變化，為深入了解Shkbp1提供了理論基礎，為了解Shkbp1對免疫的影響提供了動物水平的模型。本文針對免疫功能檢測血常規及流式等一系列實驗，旨在探討該基因缺失條件下的小鼠免疫功能的變化。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及實驗環境

Shkbp1敲除小鼠，簡稱Shkbp-/-小鼠，以C57BL/6背景，是耿建國教授(密歇根大學)饋贈[11]，由本實驗室何曉東老師飼養保種，并且開展了一些早期實驗，其結果已經發表[12]。于廣東省醫學實驗動物中心(生產許可證號SCXK(粵)2008-0002)購買C57BL/6小鼠。以上實驗用鼠均自由飼養在SPF環境條件，使用許可證號改為【SYXK(粵)2012-0125】。室內溫度維持在(24±2)℃之間，濕度保持在40%～60%，噪聲小于60 db。

小鼠飼養和鑒定:所有小鼠均于SPF 級環境下飼養，將Shkbp-1+/-雄鼠和Shkbp-1+/-雌鼠雜交，得到的子代有三種情況Shkbp-1+/-、Shkbp-1+/+、Shkbp-1-/-，經鑒定后得到實驗鼠Shkbp-/-小鼠和對照鼠Shkbp-1+/+。Shkbp-1 小鼠鑒定引物序列為：P1：5-′CTAAATCACTCCAAAGGATCC-3′；P2：5-′TACCGGTGGATGTGGAATGT-3′；P3：5-′CTAAATCA CTCCAAAGGATCCC-3′；P4：5-′ATTCATGCATTCT CCTTTGGCA-3′。PCR 反應條件為：95℃ 5 min預變性，94℃ 30 s變性，58℃ 30 s退火40 個循環；72℃ 45 s延伸，72℃ 2 min充分延伸，4℃冷卻擴增產物。P1 和P2是鑒定突變型條帶，擴增條帶為307 bp，P3和P4 是鑒定野生型條帶，擴增條帶為483 bp。在配置好的1.2%瓊脂糖凝膠中，利用TAE 電泳緩沖液進行電泳設定條件：165 V，30 min。再將凝膠放置在凝膠成像系統里，電腦成像系統里觀察PCR的電泳結果[13]。

1.2 儀器與試劑

PCR 引物購自Life上海分公司，PCR Mix購自美國Thermo Fisher公司；EDTA·K2抗凝管采集血樣；利用全自動五分類血液分析儀進行檢測分析，其型號XT-2000i，Sysmex，日本；檢測時，設置小鼠血樣程序進行檢測。流式細胞儀型號為：BD FACSCantoTMII，流式細胞術檢測抗體：CD3-FITC(11-0032)，CD4-PE(12-0041)，CD8e-PerCP-Cyanine 5.5(45-0081)以上抗體均購自eBioscience 公司。

1.3 血常規檢測

取8 周齡的Shkbp-1-/-，C57 小鼠各6 只，乙醚麻醉約1 min，眼眶取血200 μL到1 mL 的EDTA·K2抗凝管中，上機前4℃放置。

1.4 血液CD3、CD4、CD8 細胞檢測

取8 周齡的Shkbp-1-/-，C57 小鼠各6 只，眼眶取血到1 mL的EDTA·K2抗凝管中，抽取50 μL，加入CD3、CD4、CD8 抗體避光孵育30 min，用紅細胞裂解液裂解15 min，1500 r/min，離心5 min；棄上清液，用0.5% BSA 1 mL 細胞重懸，1 500 r/min，離心5 min，棄上清液；重復1次，取200 μL 混勻，上機檢測[14]。

1.5 脾臟CD3、CD4、CD8 細胞檢測

以上小鼠摘除脾臟，用0.5% BSA 在0.22 mm 尼龍篩網研磨過濾，取篩網下的液體50 μL，加入CD3、CD4、CD8 抗體避光孵育30 min，用紅細胞裂解液裂解10 min，1 500 r/min，離心5 min；棄上清液，用0.5% BSA 1 mL 細胞重懸，1 500 r/min，離心5 min，棄上清；重復1次，取200 μL 混勻，上機檢測。

1.6 骨髓CD3、CD4、CD8 細胞檢測

將以上小鼠后腿取下，抽提骨髓，同上述分離單細胞，進行流式實驗檢測。

1.7 統計學方法

實驗涉及的數據統計方法：采用M依SD 或中位數表示，利用Gradprim 5.0 軟件，采用t檢驗，假設條件P<0.05 具有統計意義。

2 結果

2.1 Shkbp-1-/-小鼠基因型鑒定

Shkbp1敲除小鼠構建是敲除了Shkbp1基因的1-6個六個外顯子而獲得的(圖1A)。將Shkbp-1+/-雄鼠和Shkbp-1+/-雌鼠雜交，得到的子代有三種情況Shkbp-1+ /-、Shkbp-1+ / +、Shkbp-1-/-，經鑒定后得到實驗鼠Shkbp-1-/-小鼠和對照鼠Shkbp-1+/+。其中野生條帶在483 bp處，突變條帶在307 bp處(圖1B)。

2.2 Shkbp-1-/-小鼠血常規檢測變化

通過全自動五分類血液分析儀分析血液，設置小鼠血液分類檢測程序。檢測正常生理條件8周齡的Shkbp-1-/-小鼠與同周齡的C57對比，白細胞總數無明顯差異(圖2A)。在白細胞分類中，Shkbp-1-/-小鼠與C57相比，淋巴細胞絕對計數有降低趨勢，但無顯著差異(圖2B)；單核細胞絕對計數，兩組之間無差異(圖2C)。但是，Shkbp-1-/-小鼠與C57相比，中性粒細胞和嗜酸性粒細胞有增高趨勢(圖2D-圖2E)，并且有顯著差異(P<0.05)。

2.3 Shkbp-1-/-小鼠外周血中CD4+CD8+雙陽性細胞數目降低

T細胞是重要的免疫細胞，CD3+抗體標記的是T淋巴細胞，它是胸腺依賴淋巴細胞，其具有多種重要的免疫功能。不同的免疫功能與其細胞膜上的分化抗原(CD)的種類相關聯，其中CD4和CD8是關鍵的分化抗原。為探究它是否發生變化，我們利用流式檢測CD3+，CD4+，CD8+細胞亞群的變化，結果發現，將C57 小鼠和Shkbp-1-/-小鼠的外周血進行紅細胞裂解，而后標記CD3、CD4、CD8 抗體，用流式細胞技術進行檢測[15，16]。將CD3 陽性細胞進行設區域設門(圖3A和3B)。檢測結果顯示實驗組小鼠CD4+CD8+雙陽性細胞絕對計數和百分比都有下降趨勢，與正常小鼠對比(圖3E～圖3F)，差異明顯(P<0.05)[17，18]。CD4+、CD8+細胞絕對計數及百分比無統計學差異，所以數據未展示。

2.4 Shkbp-1-/-小鼠骨髓中CD3+、CD4+細胞絕對計數升高

骨髓是免疫器官中樞免疫器官之一。主要作用為造血及B細胞分化發育提供場所，為再次體液免疫應答發生提供場所[19]。同樣，制備單細胞懸液后，進行流式檢測，將CD3陽性細胞進行設區域設門(圖4A～圖4B)，流式檢測CD4 和CD8 細胞(圖4C～圖4D)。檢測結果顯示實驗組小鼠CD3細胞絕對計數和百分比都有上升趨勢，與正常小鼠對比(圖4E～圖4F)，差異明顯(P<0.05)。實驗組小鼠CD4細胞絕對計數也有上升趨勢(圖4G)，差異明顯(P<0.05)。

2.5 Shkbp-1-/-小鼠脾臟中CD3+、CD4+、CD8+、CD4+CD8+雙陽性細胞均顯著減少

脾臟是機體最大的免疫器官，占全身淋巴組織總量的25%，含有大量的淋巴細胞和巨噬細胞，是機體細胞免疫和體液免疫的中心[20，21]。通過制備單細胞懸液，進行流式檢測，將CD3 陽性細胞進行設區域設門(圖5A～圖5B)，流式檢測CD4 和CD8 細胞代表圖(圖5C和圖5D)。結果提示：Shkbp-/-小鼠脾臟中CD3+絕對計數降低(圖5E)，并且有顯著差異(P<0.001); CD4+絕對計數降低(圖5F)，有顯著差異(P<0.01);CD8+絕對計數降低(圖5G)，有顯著差異(P<0.001)。并且CD4+CD8+雙陽性細胞也降低(圖5H)，差異顯著(P<0.001)。

注：A: Shkbp-1-/- 小鼠的構建，我們的小鼠為敲除了前六個外顯子構建的；B：Shkbp-1-/- 小鼠的鑒定，2號為Shkbp-1+/+ 基因型小鼠，4號為Shkbp-1-/- 基因型小鼠，7號為Shkbp-1+/- 基因型小鼠。圖1 Shkbp-1-/-小鼠的構建與鑒定Note. A: Construction of the Shkbp1 knockout mice, obtained by knocking out the 1-6 exons of the Shkbp1 gene; B: Identification of Shkbp-1-/- mouse. No. 2 is of Shkbp-1 +/+ genotype mouse, No. 4 is of Shkbp-1 -/- mouse genotype, No. 7 is of Shkbp-1+/- genotype mouse.Fig.1 Construction and identification of the Shkbp-1 - / - mice

圖2 全自動血液細胞分類儀檢測小鼠血液中白細胞分類變化Fig.2 Changes of leukocyte classification in the blood of mice detected with an automatic blood cell sorter. *P<0.05, **P<0.01

注：A, B: 流式檢測C57 小鼠和Shkbp-1-/- 小鼠血液中CD3+ 淋巴細胞的區域設門; C、D：流式檢測CD4和CD8細胞；E：CD4+CD8+ 雙陽性細胞在CD3+ 細胞中的絕對計數；F：CD4+CD8+ 雙陽性細胞占CD3+ 細胞的百分比;*p<0.05圖3 Shkbp-/-小鼠血液中CD4+CD8+ 雙陽性細胞降低Note. A, B: The gated area of CD3 + lymphocytes in the blood of C57 mice and shkbp-1-/- mice. C, D: CD4 and CD8 cells detected with flow cytometry; E: The absolute number of CD4 +CD8 + double-positive cells in CD3+ cells; F: Percentage of CD4+CD8+ double positive cells in CD3+ cells. *P<0.05.Fig.3 Count of CD4+CD8+ double-positive cells is decreased in the blood of Shkbp-1- / - mice

注：A、B: 流式檢測C57 小鼠和Shkbp-1-/- 小鼠骨髓中CD3+ 淋巴細胞的區域設門；C、D：流式檢測CD4和CD8細胞；E、F：CD3+ 細胞在骨髓細胞中的絕對計數及百分比；G：CD4+ 細胞在CD3+ 細胞中的絕對計數;* 表示P<0.05圖4 Shkbp-/-小鼠骨髓中CD3+、CD4+升高Note. A, B: The gated area of CD3 + lymphocytes in the bone marrow of C57 mice and shkbp-1-/- mice.C, D: The CD4 and CD8 cells detected by flow cytometry. E,F: Absolute number and percentage of CD3+ cells in the bone marrow cells. G: Absolute number of CD4 + cells in the CD3+ cells, *P<0.05.Fig.4 The Count of CD3 +, CD4 + double-positive cells is increased in the bone marrow of Shkbp-1- / - mice

注：A、B: 流式檢測C57 小鼠和Shkbp-1-/- 小鼠脾臟中CD3+ 淋巴細胞的區域設門; C、D：流式檢測CD4 和CD8 細胞；E：CD3+細胞在脾臟細胞中的絕對計數；F、G、H：CD4+ 細胞、CD8+細胞、CD4+CD8+ 雙陽性細胞在CD3+ 骨髓細胞中的絕對計數及百分比。*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001 圖5 Shkbp-/-小鼠脾臟中CD3+、CD4+、CD8+、CD4+CD8+ 雙陽性細胞降低Note. A, B: Flow cytometry detection of spleen CD3+ lymphocytes gated area in the C57 mice and Shkbp-1-/- mice. C, D: Detection of CD4 and CD8 cells by flow cytometry; E: Absolute number and percentage of CD3+ cells in spleen cells. F, G, H: Absolute count and percentage of CD4+ cells, CD8+ cells, and CD4+CD8+ double-positive cells in CD3+ cells, *P<0.05, **P<0.01, *** P<0.001Fig.5 The counts of CD3+, CD4+, CD8+, and CD4+CD8+ double positive cells are significantly reduced in the spleen of Shkbp-1-/- mice

圖6 Shkbp-1-/-小鼠流式細胞技術檢測結果Fig.6 Results of flow cytometry detection of Shkbp-1-/- mice

3 討論

Shkbp1是調控EGFR降解相關的分子，我們的研究表明Shkbp基因小鼠免疫細胞和血液細胞出現異常。本研究結果顯示，骨髓中CD3+、CD4+細胞數目升高，對照組血液中CD4+CD8+雙陽性細胞數目降低，并且在脾臟組織中，流式結果顯示其CD3+、CD4+、CD8+、CD4+CD8+雙陽性細胞數目均呈下降趨勢。(如圖6)脾臟為最大的免疫器官，淋巴細胞數量豐富。一般來說，T細胞一旦成熟，就隨血流離開胸腺進入外周免疫器官或外周血。但是，我們發現Shkbp1敲除小鼠的脾臟中各種免疫細胞均顯著降低，提示Shkbp1在血液細胞的分化成熟調控中有重要作用。

在本研究中，我們采用的是專門設置檢測小鼠血液的儀器程序來檢測血常規，摒棄了原來用臨床檢測小鼠血常規的不足。但是，同我們以前的結果相比，對照組C57小鼠白細胞總數相差5.5×109個/L左右，淋巴細胞數量相差1.5×109個/L左右，單核細胞數量相差0.8×109個/L左右。其原因可能是：(1)在季節上，存在冬夏兩個季節氣溫的差異。(2)在小鼠來源問題上，本實驗所用的C57小鼠為廣東省實驗動物中心購買后于本實驗室動物房內飼養繁殖使用，以前所用的C57小鼠于廣東省實驗動物中心購買后直接使用。 其原因有待進一步深入檢測和了解，我們一直在關注該問題。

另外，還利用流式細胞儀檢測細胞亞群。此次研究取材于8周大小的Shkbp-/-小鼠及對照組C57小鼠，對照組及實驗組各取材6只。取其外周血進行流式測定，研究結果顯示：實驗組CD4+CD8+雙陽性細胞數目降低，目前關于這一概念的相關報道較少。近年來，越來越多的證據表明：人類和其他動物外周血中存在少量CD4+CD8+雙陽性T細胞，并具有獨特的免疫活性。至于為什么實驗組CD4+CD8+雙陽性細胞數目降低，目前尚不清楚，仍需做進一步研究。

胚胎時期的脾臟曾一度為造血器官，可產生各種血細胞。出生后脾臟在異常情況下可髓外造血，但脾臟仍能制造淋巴細胞等與免疫相關系的細胞和物質。它有過濾血液的作用，還會對新生的紅細胞進行必要的“修整”，并貯有大量的血小板。根據以往的報道，Shkbp1可以競爭抑制CIN85和c-Cbl的結合,從而阻斷表皮生長因子受體的內吞和降解,也能上調表皮生長因子受體相關的報告基因的轉錄水平,那么是否Shkbp1可能也是通過與CIN85競爭引起了c-Cb-1變化，參與了血液的分化，有待進一步研究。

總之，我們研究結果表明Shkbp1參與血液的成熟分化，并影響了免疫細胞數量的改變，為深入了解血液的分化奠定了基礎。

4 致謝

本研究由國家自然基金(No.81472336 和No.31471290)和廣東省科技計劃(2015A030302086、201-4A020212313和2015A030302085)共同資助，感謝廣東省實驗動物監測所羅挺老師在流式檢測方面給予的支持。

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Effects of Shkbp1 deletion on mouse T lymphocyte subsets

LIU Qing, ZHANG Xiao-han, YANG Ming-ming, ZHOU Ze-qi, WANG Li-jing, LI Jiang-chao

(Guangdong Pharmaceutical University，School of Basic Courses, the Vascular Biology Institute, Guangzhou 510006，China)

Objective Shkbp is also called Shkbp1, can competitively inhibit binding CIN85 and c-Cbl, thereby blocking the epidermal growth factor receptor (EGFR) endocytosis and degradation, to play a role in tumor promotion. This study aims to explore the changes in blood cell classification and T cell subsets in blood, bone marrow, and spleen in Shkbp1-deletion (Shkbp-1- / -) mice. Methods Shkbp-1- / -transgenic mice were identified by PCR genotyping. Blood cell classification was performed using an automatic classification system. Flow cytometry was used to detect the T lymphocyte subsets in the blood, bone marrow, and spleen of Shkbp-1- / -and control mice. Results Routine blood examination showed that neutrophils and eosinophils tended to increase and showing significant differences, and there was no significant difference in lymphocytes. The flow cytometry results showed that there was a decrease of CD4+CD8+double positive cells and increase of bone marrow CD3+and CD4+cells in the control group. However, there was a decreasing trend of CD3+, CD4+, CD8+, and CD4+CD8+cellsin the spleen tissues. Conclusions Shkbp1 is involved in the maturation and differentiation of blood cells, and affects the number of immune cells. This study lays a foundation for the study of how Shkbp1 is involved in the differentiation of blood cells.

Shkbp-1; Leukocytes; T cell subsets; CD3+, CD4+, CD8+, CD4+CD8+lymphocytes；Genetically engineered mice

國家自然基金(No.81472336 和No.31471290)和廣東省科技計劃(2015A030302086 和2014A020212313) 共同資助。

劉擎(1992-)，女，研究生，專業：病理學與病理生理學。Email:liuqing6620@163.com。

李江超(1976-)，男，副研究員，研究方向：腫瘤微環境。Email:lijiangchao1234@163.com。

R-33

A

1671-7856(2017) 04-0056-07

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.04.010

2016-11-16