抑瘤素M通過誘導衰老抑制肝癌細胞增殖*

張艷艷 駱 瑩 吳國珍 王 鵬 焦曉磊 李雅玥 高英堂 朱爭艷 楊斌

抑瘤素M通過誘導衰老抑制肝癌細胞增殖*

張艷艷①駱 瑩②③④吳國珍①王 鵬②③④焦曉磊②③④李雅玥②③④高英堂②③④朱爭艷②③④楊斌②③④

目的：通過分析抑瘤素M（oncostatin M，OSM）對肝癌細胞生長的效應，研究其影響細胞增殖的分子機制。方法：OSM處理SMMC-7721和HepG2肝癌細胞系，觀察細胞的增殖速率和形態變化，結合特異性β-半乳糖苷酶染色和細胞周期分析，研究OSM是否通過誘導肝癌細胞進入衰老狀態來抑制其增殖；進一步通過監測細胞周期抑制蛋白p16、p21、p27和癌基因c-Myc的表達變化，分析OSM誘導細胞衰老的原因。結果：OSM可以抑制肝癌細胞系生長，且抑制率呈現一定劑量依賴性；細胞形態變化和β-半乳糖苷酶染色進一步證實OSM可誘導細胞衰老。細胞周期分析表明OSM阻滯肝癌細胞于G0/G1期，并伴隨p21和p27周期抑制蛋白的表達增高。最后，通過分析STAT3信號途徑下游癌基因c-Myc的轉錄與蛋白水平，表明OSM可能是通過癌基因的激活而誘導細胞的衰老。結論：由癌基因激活而導致的細胞衰老，是機體的一種防御機制。OSM通過激活STAT3信號途徑、上調癌基因c-Myc表達的同時，也加速了細胞的衰老，從而最終表現為對肝癌細胞增殖的抑制作用。

肝癌細胞抑瘤素M細胞衰老c-Myc增殖

抑瘤素M（oncostatin M，OSM）屬于白細胞介素-6家族成員，是由活化的T淋巴細胞、單核細胞和巨噬細胞等分泌產生的一種多功能的細胞因子［1］。OSM最初是在黑色素瘤中被發現可以抑制腫瘤細胞生長并因此被命名，然而作為一種多功能的細胞因子，OSM在器官發育、組織損傷與再生等方面也起到重要的調控作用［2］。在分子途徑上，OSM通過與細胞膜受體gp130結合，激活下游STAT3、MAPK和PI3K等多種信號通路［3-4］。因此在不同的環境下，OSM對細胞增殖或分化可能起著不同甚至完全相反的作用。已有研究報道，在肝癌發展的早期，血清中OSM含量增高，肝組織中的OSM受體表達也升高［5-6］，然而這種OSM信號增強對腫瘤形成的具體作用亟需進一步研究。本研究主要通過體外實驗研究OSM對肝癌細胞的效應和機制，并據此提出OSM對早期肝癌的形成可能具有抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料2012年11月至2015年1月健康對照組和肝病患者88例均選自天津醫科大學第三中心醫院。其中健康對照組15例，年齡47（37～59）歲；乙型肝炎患者15例，年齡44（28～56）歲；肝硬化患者15例，年齡45（32～47）歲；肝癌患者43例，年齡54（30～71）歲。

1.1.2 主要試劑肝癌細胞系（SMMC-7721、HepG2）購自中國科學院上海生物化學研究所，用DMEM/F12（Gibco，美國）完全培養基，置于37℃、5% CO2培養箱內貼壁培養；主要試劑包括：胰酶（Gibco，美國）；重組人抑瘤素M（Peprotech，美國）；鼠抗人單克隆β-actin（sigma，美國）；兔抗人單克隆p16、p21、p27和c-Myc抗體（Abcam，美國）；羊抗鼠單克隆抗體、羊抗兔單克隆抗體（cell signal technology，美國）；TriZol（Invitrogen，美國）；HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒、蛋白酶抑制劑混合物、RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、蛋白示蹤上樣緩沖液（5×）、顯影定影試劑盒（康為世紀，北京）；PCR引物由北京曼特德曼生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 酶聯免疫吸附實驗用人OSM酶聯免疫吸附測定試劑盒（Elabscience）檢測血清。

1.2.2 細胞增殖實驗將肝癌細胞系以5×103個/mL接種在96孔板中，置于培養箱中培養1 d后，加入不同濃度OSM（2.5、10、50 ng/mL）培養6 d，將其置于長時間動態觀察儀（Incu Cyte Zoom，Essen BioScience，美國）中，每12 h拍照記錄1次細胞匯合度，生成細胞生長曲線。

1.2.3 免疫印跡提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，取25 μg樣品在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）上進行變性電泳；濕法轉膜后將PVDF膜置于5%脫脂奶粉封閉2 h，加一抗（1:1 000）后4℃過夜孵育，洗滌后加入相應的二抗（1:4 000），室溫孵育1 h；采用ECL化學發光顯色，經顯影、定影后掃描條帶。

1.2.4 細胞周期將肝癌細胞系以5×103個/mL接種在6孔板，待其24 h貼壁后，加入10 ng/mL OSM，放置在培養箱中培養6 d，并設置無藥對照組。收集細胞，PBS洗2次，70%乙醇4℃過夜固定，然后棄乙醇，PBS洗3次，加入4 μL RNase和0.4 mL碘化丙啶混合液，輕輕吹打混勻細胞，避光染色20 min，流式細胞儀（BD，FACSCanto II，USA）檢測細胞周期變化。

1.2.5RT-qPCRTRIzol法提取細胞總RNA，逆轉錄cDNA參照試劑使用說明書。熒光定量PCR反應在ViiATM7 96孔板上進行，擴增體系為25 μL，包含20 μL SYBR Green PCR master mix、1 μL Ex Taq HS、2 μL cDNA模板、正反向引物各1 μL，DEPC水補足至25 μL。反應條件為：95℃3 min預變性；72℃10 s、95℃15 s、60℃32 s，共40次循環；PCR引物序列如表1所示；數據分析用2-ΔΔT法比較表達差異。

表1RT-PCR引物序列Table1 Primer sequences of RT‐PCR

1.2.6 衰老相關-β半乳糖苷酶染色使用衰老相關-β半乳糖苷酶染色試劑盒（cell signal technology），將培養細胞以5×103個/mL接種在6孔板中，用10 ng/mL OSM處理細胞7 d后加入固定液，在室溫下固定15 min。PBS沖洗培養板2次后，在每個培養孔中加入1 mL β-半乳糖苷酶染色液，干燥培養箱中37℃過夜孵育，顯微鏡下觀察染色情況。

1.3 統計學分析

應用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。將各組數據分別進行正態分布檢驗。正態分布計量資料以x±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析。非正態分布計量資料以中位數和四分位數間距表示，多組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 ELISA測定血清中OSM濃度

利用多個獨立樣本Kruskal-Wallis檢驗發現各組之間差異具有統計學意義（P＜0.001）。然后采用秩和檢驗進行兩兩之間比較，結果如圖1所示：健康對照和乙型肝炎患者中的OSM水平無明顯差異（P=0.852），而在肝硬化、肝癌患者中均顯著升高（P＜0.001）。表明血清中OSM升高在肝癌的進程中具有一定的階段特異性。

2.2 OSM抑制肝癌細胞生長

為研究OSM對肝癌細胞的作用效應，首先用系列濃度（2.5、10.0、50.0 ng/mL）的OSM處理肝癌細胞系SMMC-7721和HepG2，連續觀測6 d細胞生長情況，結果顯示OSM可抑制細胞增殖，并呈一定劑量依賴性（圖2）。

圖1 不同類型肝病患者中血清OSM含量Figure1 OSM levels in the serum of patients with different liver diseases

圖2 OSM處理肝癌細胞系生長曲線Figure2 Growth curve of liver cancer cell lines treated with OSM

2.3 OSM誘導肝癌細胞衰老

在OSM抑制細胞增殖的同時，觀察發現隨著OSM作用時間的延長（3 d以后），隨著細胞增殖速率下降，其形態也逐漸發生變化，開始呈現增大和扁平狀、胞質內顆粒狀物增多等細胞衰老的特征（圖3A）。進一步通過衰老相關的β-半乳糖苷酶染色實驗顯示，在OSM處理7 d的HepG2細胞中，呈深綠色陽性染色的細胞數量明顯增加（圖3B）。上述實驗結果提示，OSM抑制肝癌細胞增殖主要是通過誘導細胞衰老。

圖3 OSM誘導HepG2細胞衰老（×400）Figure3 Senescence‐like characteristics induced by OSM in HepG2 cells (×400)

2.4 OSM阻滯細胞周期在G0/G1期

除形態變化外，衰老細胞的另一個重要特征是逐漸退出細胞周期，永久性停滯于G0期。為分析OSM作用肝癌細胞后的周期變化趨勢，用OSM（10 ng/mL）處理SMMC-7721、HepG2細胞6 d后進行流式細胞術分析。結果表明，經藥物處理過后G0/G1期的細胞數量升高，而S期的細胞量減少，即OSM可以將細胞周期阻滯于G0/G1期，從而抑制細胞增殖（圖4）。

2.5 OSM上調周期依賴性激酶抑制劑p21、p27表達

細胞周期的阻滯常會伴隨周期依賴性激酶（cy?clin-dependent kinases）抑制劑的激活，主要包括p16、p21和p27等蛋白的表達增強。本研究中，OSM可促進p21和p27在轉錄和蛋白兩個層次都呈現表達升高，特別是p21的表達還呈現明顯的劑量依賴性（圖5）。由于p21是重要抑制基因p53下游的靶基因，p21表達增高提示OSM可能間接激活p53蛋白的抑癌功能。

圖4 OSM誘導肝癌細胞G0/G1期阻滯Figure4 Prolonged cycle arrest at G0/G1induced by OSM in live cancer cells

圖5 細胞周期相關基因表達檢測Figure5 Expression of genes regulating cell cycle

2.6 OSM上調癌基因c-Myc的表達

細胞衰老的一個內在因素是癌基因的異常激活，這種形式的衰老也稱作癌基因誘導的細胞衰老（oncogeneinduced senescence）。為了探尋OSM促進細胞衰老的關鍵環節，本研究分析OSM可能激活的MAPK、STAT3和PI3K信號途徑，其中癌基因c-Myc是STAT3下游的一個重要靶基因。進一步通過RT-qPCR和Western blot實驗證實OSM處理SMMC-7721和HepG2細胞，均促進了c-Myc蛋白的積累（圖5）和mRNA表達，且后者的增高程度還呈現一定的OSM劑量依賴性（圖6）。上述研究結果提示，OSM處理導致的肝癌細胞衰老，可能是細胞對癌基因c-Myc激活的應答，而這一過程是通過p53-p21信號途徑來介導的。

圖6 RT-qPCR檢測肝癌細胞中c-Myc的表達Figure6 c‐Myc expression quantified by RT‐qPCR in liver cancer cells

3 討論

抑瘤素M曾因能夠抑制黑色素瘤細胞生長而得名，但隨后的研究逐漸表明，這一細胞因子的效應并非是單一的：對有些類型的腫瘤細胞表現為抑制，而對另一些類型則表現為促進增殖。這些現象反映出OSM作用機制的復雜性，但隨著研究的積累，也發現OSM這兩種完全相反的效應與癌癥的發展階段或惡性程度具有一定的相關性。總體來說，對于正常上皮細胞和一些早期腫瘤，OSM發揮抗增殖、抑制癌癥進展的作用［7］；而對于惡性程度或轉移性較高的腫瘤，OSM表達的增高卻與不良預后相關［8］。這種現象與轉化生長因子-β（TGF-β）對腫瘤細胞的效應極為相似［9］。本研究中OSM抑制肝癌增殖中的分子機制，可以為上述兩種不同效應提供一種可能的解釋。

OSM誘導肝癌細胞進入衰老狀態，類似現象在OSM處理正常乳腺上皮細胞中也會出現［10］。引起細胞衰老的內在因素之一是癌基因激活，而OSM所激活STAT3信號途徑下游一個重要的癌基因就是c-Myc［11］。c-Myc是促進細胞增殖的重要轉錄因子，而且與Ras癌基因導致細胞衰老一樣［12］，c-Myc的異常增強表達同樣可以通過這一途徑抑制細胞的增殖［13］。但是，癌基因激活而導致細胞衰老是需要一定前提條件的。其中一個最重要的條件就是需要細胞具有激活p53或（和）Rb這類周期負調控蛋白的能力［14］。然而對已處于進展期的癌細胞，這些蛋白的基因往往會發生突變或失活。如約50%的癌癥患者中都存在p53的功能喪失。這也就解釋了為何OSM對于已發展成為晚期階段的腫瘤大多表現為進一步的促進增殖。這一機制在肝癌細胞中也得到了有力的證實：OSM抑制正常肝細胞的增殖，但是如果通過轉入人乳頭瘤病毒（HPV）的E6、E7基因，抑制細胞的p53和Rb蛋白活性，肝細胞則會在OSM刺激下持續增殖［15］。

本研究對OSM抑制肝癌細胞現象和機制探討，具有兩點臨床意義。首先，如果將肝硬化作為肝癌發展的前期階段，這一時期OSM的升高除了作為提示疾病發展的潛在標志物外，同時在生理上也可能起到抑制早期癌變的作用。其次，OSM雖然在體外實驗中表現出腫瘤細胞的抑制，但由于其同時也激活了癌基因c-Myc的表達，因此要作為一種治療手段還存在一定風險。

[1]Tanaka M,Miyajima A.Oncostatin M.A multifunctional cytokine [J].Rev Physiol Biochem Pharmacol,2003,149(6):39‐52.

[2]Zarling JM,Todaro GJ.Oncostatin M.a growth regulator produced by differentiated histiocytic lymphoma cells[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1986,83(24):9739‐9743.

[3]Chevilier S,Fourcin M,Robledo O,et al.Interleukin‐6 family of cy‐tokines induced activation of different functional sites expressed by gp130 transducing protein[J].J Biol Chem,1996,271(25):14764‐14772.

[4]Heinrich PC,Behrmann I,M Ller‐newen G,et al.IL‐6‐type cytokine signalling through the gp130/JAK/STAT pathway[J].Biochem J, 1998,334(pt 2):297‐314.

[5]Levy MT,Trojanowska M,Reuben A.Oncostatin M:a cytokine up‐regulated in human cirrhosis,increases collagen production by hu‐man hepatic stellate cells[J].J Hepatol,2000,32(2):218‐226.

[6]Znoyko I,Sohara N,Spicer SS,et al.Expression of oncostatin M and its receptors in normal and cirrhotic human liver[J].J Hepatol, 2005,43(5):893‐900.

[7]Grenier A,Dehoux M,Boutten A,et al.Oncostatin M production and regulation by human polymorphonuclear neutrophils[J].Blood,1999, 93(4):1413‐1421.

[8]Koskela K,Pelliniemi TT,Rajam KA,et al.Serum oncostatin M in multiple myeloma:impact on disease severity and prognosis[J]. Eur J Haematol,2000,65(1):52‐56.

[9]Kajdaniuk D,Marek B,Borgiel‐Marek H,et al.Transforming growth factor beta1(TGFbeta1)in physiology and pathology[J].Endokrynol Pol,2013,64(5):384‐396.

[10]Kan CE,Cipriano R,Jackson MW.c‐MYC functions as a molecular switch to alter the response of human mammary epithelial cells to oncostatin M[J].Cancer Res,2011,71(22):6930‐6939.

[11]Zhang F,Li C,Halfter H,et al.Delineating an oncostatin M‐activated STAT3 signaling pathway that coordinates the expression of genes involved in cell cycle regulation and extracellular matrix deposition of MCF‐7 cells[J].Oncogene,2003,22(6):894‐905.

[12]Benanti JA,Galloway DA.The normal response to RAS:senescence or transformation[J]?Cell Cycle,2004,3(6):715‐717.

[13]Van RJ,Felsher DW.Myc and a Cdk2 senescence switch[J].Nat Cell Biol,2010,12(1):7‐9.

[14]Ben‐Porath I,Weinberg RA.The signals and pathways activating cel‐lular senescence[J].Int J Biochem Cell Biol,2005,37(5):961‐976.

[15]Levy G,Bomze D,Heinz S,et al.Long‐term culture and expansion of primary human hepatocytes[J].Nat Biotechnol,2015,33(12):1264‐1271.

（2016‐11‐30收稿）

（2017‐04‐06修回）

（編輯：鄭莉校對：孫喜佳）

Inflammatory cytokine oncostatin M suppresses growth of liver cancer cells by inducing senescence

Yanyan ZHANG1,Ying LUO2,3,4,Guozhen WU1,Peng WANG2,3,4,Xiaolei JIAO2,3,4,Yayue LI2,3,4,Yingtang GAO2,3,4,Zhengyan ZHU2,3,4,Bin YANG2,3,4

1Clinical School of Tianjin Medical University at Tianjin Third Central Hospital;2Hepatobiliary Disease Institute,Tianjin Third Central Hos‐pital;3Tianjin Key Laboratory of Artificial Cells;4Artificial Cell Engineering Technology Research Center of National Health and Family Planning Commission of the People's Republic of China,Tianjin 300170,China

Zhengyan ZHU;E‐mail:zhuzhengyan59@163.com

Objective:To provide a possible mechanism underlying oncostatin M(OSM)‐induced tumor growth by investigating the ef‐fects on growth of liver cancer cells and its molecular pathway.Methods:Cell growth rates were analyzed after OSM treatment in hu‐man liver cancer cell lines‐SMMC‐7721 and HepG2.Cellular senescence based on growth arrest and morphologic phenotype of cells was detected by senescence‐associated β‐galactosidase(SA‐β‐gal)staining.Cell cycle profile was examined by flow cytometry.The ex‐pression of key regulators of cell proliferation including cyclin‐dependent kinase inhibitors(p16,p21,and p27)and c‐Myc were ana‐lyzed at the level of mRNA and protein.Results:OSM suppressed cell proliferation in a dose‐dependent manner.Upon drug treatment, morphological changes of cells notably implicated a senescent phenotype,which was further supported by the positive SA‐β‐gal stain‐ing.Meanwhile,OSM induced an increased proportion of cells at G0/G1phase,which corresponded to the elevated expression of p21 and p27 at mRNA and protein levels.Unexpectedly,oncogene c‐Myc was also dramatically upregulated upon OSM treatment.Conclusion:As a key regulator of cell proliferation and survival,c‐Myc can be upregulated though the OSM‐activated STAT3 pathway.While in short term,such hyperactive oncogene would induce cellular senescence as a barrier to transformation in cells with intact p53 machin‐ery.These findings suggest that the elevated OSM during the earliest stages of liver cancer might serve as a tumor suppressor.

liver cancer cells,oncostatin M,senescence,c‐Myc,proliferation

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.08.382

①天津醫科大學三中心臨床學院生物化學與分子生物學專業（天津市300170）；②天津市三中心醫院，天津市肝膽疾病研究所；③天津市人工細胞重點實驗室；④衛生部人工細胞工程技術研究中心

*本文課題受天津市科委應用基礎與前言技術研究計劃項目（編號：15JCQNJC45700，15JCQNJC11500）和天津市衛生行業重點攻關項目（編號：12KG107，12KG108）資助

朱爭艷zhuzhengyan59@163.com

This work was supported by the Municipal Key Project of Tianjin Health Bureau(No.112KG107,12KG108)and the Application Founda‐tion and Advanced Technology Program of Tianjin Municipal Science and Technology Commission(No.15JCQNJC45700,15JCQN‐JC11500)

張艷艷專業方向為生物化學與分子生物學研究。

E-mail：yyzhang1113@163.com