高效液相色譜法檢驗水產品中甲醛含量的不確定度探究

林栩+郭媛媛

摘 要：目的：探究高效液相色譜法檢驗水產品中甲醛含量的不確定度，進而評定此方法檢驗的正確性，以期進一步提升檢驗質量控制的水平。方法：根據相關技術規范要求，依據測定的結果來建立其數學的模型，并科學評估各不確定度分量，再在計算擴展、合成的不確定度，最終得出測量不確定度報告。結果：高效液相色譜法檢驗水產品中甲醛含量是（4.16±0.13）mg/kg，而從高效液相色譜法檢測水產品甲醛含量不確定分量可以看出，標準溶液制備是導致不確定度的主要因素，其次是測量重復性、樣品處理的過程、樣品標準曲線的擬合；而樣品的定容、樣品的稱量不確定度可以忽略不計。結論：使用高效液相色譜法檢驗水產品中甲醛含量的不確定度，能夠有效提升水產品監管的質量和水平。

關鍵詞：高效液相色譜法；水產品；甲醛含量；不確定度

甲醛是常見的致癌以及致突變的物質，該物質的毒性較強，極易危害到人們的身心健康及生命安全。我國已明令禁止國家標準外食品以任意一種形式使用甲醛；但不少商販為最大限度謀取私立，仍通過各種渠道、各種防腐方式在水產品中使用甲醛，最終導致甲醛含量超標，造成食品安全問題[1]。

當前，檢驗檢疫局多使用SC/T3025-2006標準中高效液相色譜法檢測甲醛，此種檢測方法的準確性比較高，具有較高的抗干擾能力；但此種檢測方法的過程較為復雜。本次研究主要通過2，4-二硝基苯肼柱前衍生法檢測水產品中甲醛的不確定，其目的在于尋找出影響不確定的主要因素，進而為建立科學、有效地質量控制方式提供科學依據以及理論基礎，進而提升水產品質量管理力度。現將研究報告總結如下：

1.實驗儀器和試藥

1.1實驗儀器

使用由日本島津公司生產的、型號為LC-20AD的高效液相色譜儀器，電子天平型號選擇XA204（生產企業：上海梅特勒托利多儀器有限公司）；甲醛標準溶液以及2，4-二硝基苯肼（DNPH）乙腈溶液、乙腈、色譜純的環己烷、鹽酸-氯化鈉溶液和磷酸氫二鈉溶液；水產品為市面上銷售的魷魚。

1.2檢驗方法

1.2.1檢驗原理

酸性環境下甲醛和DNPH衍生反應生成2，4-二硝基苯腙；同時，使用高效液相色譜法測定苯腙類衍生物，其目的在于檢測水產品中的甲醛含量。其中衍生反應的化學式為：C6H3（NO2）2NHNH2+HCH0→C6H3（N02）2NHN=C—H2+H2O[2]。

1.2.2檢測方法

制備標準溶液的方法：依次稀釋甲醛標準溶液，并將其配置為0.2、0.5、1.0、2.0、5.0mg/L系列標準溶液。

樣品的測定方法：均勻地搗碎樣品，并用超聲提取30min后過濾。其次，將提取液和DNPH放置在60℃的水中進行衍生，時間為20min；最后，采用環己烷進行提取。

1.2.3色譜的條件

①流動相為：乙腈-水（62：38），②色譜柱為：Welch Xtimate C18柱（250mm×4.6mm，5μm），③流速為：1.0mL/min，波長為365nm、柱溫為40℃；進樣量為：20μL。

1.3建立數學模型

數學模型建立如下：

X=C×V×1000/m×1000

式中，X是樣品中甲醛含量，C是標準曲線上所得試液甲醛濃度，V是試樣定容的體積，m是試液代表的質量。

1.4不確定度分量的測量來源

依據檢驗的過程、樣品的處理以及數學模型，可以得出水產品中甲醛含量不確定分量的來源：標準曲線擬合以及溶液制備、樣品的定容以及樣品的稱量、測量的重復性以及樣品處理的過程等。

2.結果

2.1標準曲線擬合以及溶液制備時的不確定度

2.1.1標準溶液制備時所產生的不確定度

標準溶液制備過程中，所產生的不確定度主要表現在三個方面：其一，配置過程中所使用玻璃量具的校準度；其中，玻璃量具的校準可以依據《常用玻璃量具檢驗規程》中相關的要求，并參照三角分布進行選擇；此外，還應將制備過程中玻璃量具使用的次數（n）納入到不確定度的考慮范圍內[3]。

式中，MPE是最大允許的誤差，u是不確定主度，urel是相對標準不確定度。

其二，標準品純度；標準品的純度，可參考標準物質證書中標準物質甲醇溶液不確定度，約為3%。其三：溫度效應；實驗室的溫度波動應將其控制在一定范圍內，通常△T為±3℃：而溶液體積膨脹的系統α應為2.1×10-4℃；使其符合矩形分布，k= 。由此可以得出，標準溶液制備時溫度效應的不確定度，見表1：

2.1.2標準曲線擬合不確定度

標準溶液濃度-色譜峰面積曲線的擬合主要使用的是最小二乘法，但在擬合的過程中，須對每個濃度進行三次測定（結果見表2）。經曲線擬合后，可得出線性回歸的方程：A=998994C+108 546，其中，斜率b=998994，截距α=108 546，相關的系數R2=1，由此可以得出峰面積標準的偏差是：

上述公式中，SR是標準溶液峰面積殘差標準差，P是試液在使用了該曲線測定次數，其中，P=9；n則是標準系列總測定的次數，n=15； 則是試液在使用了該曲線測定9次以后，待測定濃度平均值， =0.8394g/L；

則是標準系列的平均濃度； 則是標準系列溶液濃度殘差平方和。

2.2樣品的稱量以及樣品的定容不確定度

2.2.1樣品稱量不確定度

樣品稱量不確定度主要因稱量過程中天平MPE構成，鑒定證書中天平MPE應在±1mg之間，并滿足正態分布，其中，置信的概率是99.7%時的k=3，那么，u（mMPD）=1/3=0.34mg。但因樣品質量主要是通過樣品稱量與容器清零所獲得，因此，共同到兩次電子天平，得出，

，其中，m為樣品的質量，m=20.1820g。

2.2.2樣品定容不確定度

樣品稱量之后，采用100mL的容量瓶對樣品進行定容，其中，樣品定容體積相對標準不確定度是 。

2.3測量重復性不確定度

測量重復性的不確定度可劃分為A類，本次研究主要對同一樣品進行9次重復性、獨立檢測，其結果見表3：

樣品制備過程中不確定度主要是對樣品添加三種不同質量濃度的待測物，并分裂對其進行五次測量與回收，再在對其回收率進行評定，其中，評定的類別為A類，具體結果見表4：

2.4樣品回收率的不確定度

2.5合成的不確定度

合成的不確定度主要是根據各個不確定度的分量得出相對合成的不確定，其中：urel（Cstd）為1.13×10-2，urel（std）為1.54×10-3，urel（m）為2.34×10-5，urel（V定容）為1.54×10-3，urel（n）為1.54×10-3，urel（ree）為1.54×10-3。

而合成的不確定公式為：u=urel× =1.25×10-2。

2.6擴展的不確定度

若取置信的概率95%，k=2時，擴展不確定度則是U=k×u=2.49×10-2。

2.7測量不確定度的報告

本次研究水產品中，甲醛的含量是（0.84±0.025）mg/L，其中，樣品的制量是20.1820g；依據所建立的數學模型，可以得出結果是：（4.16±0.13）mg/kg。

3.結語

使用高效液相色譜法檢驗水產品中甲醛含量是（4.16±0.13）mg/kg，而從高效液相色譜法檢測水產品甲醛含量不確定分量可以看出，測定不確定度從大到小依次是：標準溶液制備、測量重復性、樣品處理的過程、樣品標準曲線的擬合、樣品的定容、樣品的稱量。而在整個實驗的過程中，通過使用高密度玻璃器具、提升標準溶液系列的標準點數、重復測量的次數以及嚴格參照規范對樣品進行處理，能夠有效降低測量的不確定度，進而提升檢驗結果的可靠性以及準確性，最終提升實驗室控制的質量以及水產品監管的質量。

參考文獻：

[1]曹國華，鄭劍萍，杜瑋，等.柱前衍生高效液相色譜法測定鹽酸四環素原料藥中微量甲醛含量[J].中國藥業，2015，24（6）：42-44.

[2]杜光宇，張男.測定室內空氣中甲醛含量的高效液相色譜法[J].工業衛生與職業病，2016，42（2）：140-142.

[3]馬秋冉，張璐，戴青，等.柱前衍生化-高效液相色譜法檢測疫苗中游離甲醛含量[J].中國獸藥雜志，2016，50（8）：20-23.