右美沙芬對激活的小膠質細胞的抑制作用

王俊燕+李玲+張燕+李云鴻+王銀

（1.寧夏顱腦疾病重點實驗室，寧夏醫科大學，寧夏 銀川 750004；2.銀川市第一人民醫院，寧夏 銀川 750004）

摘要：目的：研究右美沙芬（DM）對激活的小膠質細胞的作用及熱休克蛋白60（HSP60）在DM神經保護中的作用機制。方法：培養BV2小膠質細胞株，分為對照組，細菌脂多糖組，（LPS），實驗組（DM）。Western-blot檢測DM對LPS激活的BV2細胞HSP60和Caspase 3的影響，ELISA檢測DM對HSP60釋放的作用。結果：LPS組中HSP60和Caspase 3的表達及釋放都比對照組顯著增加，加入DM后，這些因子的水平都明顯降低。結論：DM可能通過HSP60信號通路途徑阻止小膠質細胞的凋亡而發揮神經保護作用。

關鍵詞：熱休克蛋白60；右美沙芬；Caspase 3；小膠質細胞

中圖分類號：G642.423 文獻標志碼：A 文章編號：1674-9324（2017）18-0277-02

熱休克蛋白是機體的一類應激蛋白，在生理狀態下對機體起著保護功能。但是有研究發現，在病理情況下，很多細胞會大量表達熱休克蛋白60（HSP60），并將其釋放到胞外，引起細胞凋亡[1]。右美沙芬（Dextromethorphan，DM）是一種右旋嗎啡喃化合物[2]，對動物因低血糖或腦缺血引起的神經損傷具有保護作用，DM被證明能有效抑制小膠質細胞活化，并且可抑制細胞炎癥因子如TNF-α、IL-6，NO和超氧化自由基等[3]，但是右美沙芬的作用機制目前尚不清楚。

一、材料與方法

（一）材料

右美沙芬和LPS購自Sigma公司；HSP60抗體購自ENZO公司；Caspase 3及β-actin抗體購自Cell Signaling公司；蛋白定量BCA試劑盒購自Thermo公司；ELISA試劑盒購自欣博盛公司。

（二）方法

1.小膠質細胞BV2的培養。BV2細胞培養在DEME培養基中，含10%胎牛血清。利用1μg/ml LPS處理30min后，在細胞培養液中加入DM溶液（10μM），作用24小時后收集細胞及上清。

2.Western blot檢測蛋白含量。藥物處理完畢，提取各實驗組的蛋白并收集上清液，10% SDS-PAGE分離后轉至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉膜2小時。然后加入一抗，置于4℃過夜。利用TBST洗滌膜三次，洗去未結合的一抗。最后用二抗室溫孵育1 h，利用ECL試劑顯色成像。

3.ELISA試劑盒檢測HSP60的釋放。按照HSP60 ELISA試劑盒操作說明進行實驗，最后酶標板置于酶標儀上，450nm處測定各孔光密度值（OD）。

4.統計學分析。采用SPSS11.11進行統計學分析。實驗數據用x±s表示，組間比較用方差分析，進一步比較兩兩間差異采用Student-Neuman-Keuls Test方法。

二、結果

（一）DM顯著抑制LPS激活的小膠質細胞HSP60的表達及釋放

LPS激活后的小膠質細胞中HSP60的表達明顯高于對照組，差異具有顯著性。加入DM可顯著抑制LPS引起的HSP60的升高，差異具有統計學意義（P<0.05）。對上清液進行ELISA實驗，結果顯示DM處理后，LPS引起的小膠質細胞HSP60的胞外釋放量明顯地被抑制了。

（二）DM抑制Caspase 3的表達

Western blot結果表明，LPS激活的小膠質細胞中Caspase 3的表達明顯高于對照組，在DM處理的實驗組中，Caspase 3的表達顯著下降，差別有統計學意義（P<0.05）。

三、討論

熱休克蛋白是一類應激蛋白，對機體主要起著保護作用。但是HSP60對細胞凋亡具有雙重作用。我們先前的研究發現心肌細胞中HSP60的表達和定位都發生了改變，導致心肌細胞的損傷或凋亡[4]。但是關于HSP60在神經系統中的作用的報道還很少見。

小膠質細胞的激活參與了多種神經系統退行性病變如老年癡呆癥、帕金森癥等的發生發展[5]。本研究假設HSP60在激活的小膠質細胞中高度表達，并被釋放至胞外。胞外的HSP60激活凋亡因子Caspase 3，導致周圍其他神經細胞的損傷或凋亡。本實驗證實了在LPS激活的小膠質細胞內HSP60的表達顯著增高，胞外也檢測到HSP60，并增強了Caspase 3的表達。這些結果與心肌細胞中關于HSP60的研究結果的報道一致，說明小膠質細胞活化后釋放至胞外的HSP60可進一步激活自身導致自身的凋亡。

右美沙芬可能是一種潛在的治療神經系統炎性疾病的藥物[6]。本實驗中，我們證實了DM能有效抑制小膠質細胞的激活，為一些神經退行性疾病的防治提供了潛在的藥物治療靶點。

參考文獻：

[1]Gupta S，Knowlton A A. HSP60，Bax，apoptosis and the heart [R].J Cell Mol Med. 2005，9（1）：51.

[2]Craviso GL and Musacchio JM：High-affinity dextromethorphan binding sites in guinea pig brain. I. Initial characterization [J].Mol Pharmacol. 1983a；23：619–628.

[3]Prince DA and Feeser HR：Dextromethorphan protects against cerebral infarction in a rat model of hypoxia-ischemia [J].Neurosci Lett 1988；85：291-296.

[4]Kim SC，Stice JP，Chen L，Knowlton A A. Extracellular heat shock protein 60，cardiac myocytes，and apoptosis [J].Circ Res，2009；105：1186-1195.

[5]Gonzalez-Scarano F，Baltuch G. Microglia as mediators of inflammatory and degenerative diseases[J].Annu Rev Neurosci，1999；22：219-40.

[6]Mousavi SA，Saadatnia M，Khorvash F，et al：Evaluation of the neuroprotective effect of dextromethorphan in the acute phase of ischaemic stroke [J].Arch Med Sci. 2011；7：465-469.

收稿日期：2016-11-30

基金項目：2016年國家級大學生創新創業訓練計劃項目（201610752010）

作者簡介：王俊燕（1992-），女（漢族），寧夏銀川人，寧夏醫科大學生物技術專業本科生；李玲（1973-），女（漢族），寧夏銀川人，專科，主治醫師，銀川市第一人民醫院高壓氧科，主要從事高壓氧神經科學研究；張燕（1992-），女，寧夏銀川人，寧夏醫科大學生物技術專業本科生；

李云鴻（1972-），男（漢族），副教授，碩士，寧夏醫科大學，主要從事神經生物學研究。

通訊作者：王銀（1973-），女（漢族），教授，博士，碩士生導師，寧夏醫科大學，主要從事神經生物學研究。