采用固相萃取/高效液相色譜法測定保健食品中12種雙酚類化合物的遷移量

曹晨 李文斌 宋青 孫欣 任碩 程甲 陳迪 鄧曉軍

雙酚類化合物中比較典型的有雙酚A、雙酚F、雙酚S、雙酚一A二環氧甘油醚(BADGE)、雙酚一F二環氧甘油醚(BFDGE)、酚醛清漆甘油醚(NOGE)及其衍生物等，容易造成人類的內分泌系統、免疫系統、神經系統異常，不僅具有“致癌、致突變、致畸”的危害，還會嚴重干擾人類的生殖遺傳功能。這些雙酚類物質廣泛應用于食品接觸材料的生產過程中，易通過食品包裝容器和塑料薄膜遷移至食品或飲料中，我國以BADGE和BFDGE為內涂層的食品包裝為主要成分，當與食品接觸時這些物質就可能會遷移到食品中，對人體雌雄激素比例失調起著不容忽視的作用［1］。歐盟法規(EC/1985/2 005號指令)規定對雙酚A二縮水甘油醚(BADGE)及其衍生物雙酚A－雙(2，3－二羥基丙基甘油醚)(BADGE·H2O)、雙酚A－雙(2，3－二羥基丙基醚)(BADGE·2H2O)在食品或食品模擬物中的遷移總量不超過9 mg/kg，單一各類在食品或食品模擬物中的遷移總量不超過1 mg/kg［2］。同時我國國家標準規定雙1酚S在食品或食品模擬物中的遷移限量為0.05 mg/kg［3］。目前對于環境、水樣、化妝品和食品接觸材料中雙酚類化合物檢測方法的報道較多，但是對于保健食品中雙酚殘留的研究較少。對于測定雙酚殘留可以采用氣相色譜－質譜法［4］、液相色譜 － 質譜法［5－8］，液相色譜法等［9－11］。其中氣相色譜－質譜法前處理方法操作復雜，需要對雙酚衍生化后進行測定;液相色譜－質譜法靈敏度高，但儀器和實驗耗材的成本高;液相色譜法作為常規檢測設備，采用熒光檢測方法檢測器結合前處理條件優化后也可以獲得較好的靈敏度，因此被廣泛應用于雙酚類等檢測。王延翠等［9］、汪輝等［11］采用該技術對水中雙酚A及雙酚S等雙酚類化合物進行檢測。已有的文獻中尚無對于保健食品中的多種雙酚類化合物檢測方法的報道。于2016年10月開始采用乙腈水提取，固相萃取凈化，高效液相色譜配熒光檢測器測定保健食品中12種雙酚類化合物的遷移量，方法具備簡單、高效、檢測成本低，同時滿足歐盟等國家和地區的法規要求等特點。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 LC－20高效液相色譜儀:配有熒光檢測器(日本島津公司);ProElut CARB固相萃取小柱(100 mg/3 mL，Dikma公司);BPA和BPF標準品(純度＞95%，日本TCI公司);BFDGE標準品(純度＞95%，德國 Dr．Ehrenstorfer公司);BPS標準品(純度 ＞99%，美國 Admas公司);BADGE、BADGE-H2O、BADGE-2H2O、雙酚 A－(3－氯－2－羥丙基甘油醚)(BADGE-HCl)、雙酚 A－雙－(3－氯－2－羥丙基)甘油醚(BADGE－2HCl)、雙酚 A－(3－氯－2－羥丙基)(2，3－二羥丙基醚)(BADGE-H2OHCl)、雙酚 F－雙(2，3－二羥基丙基醚)(BFDGE－2H2O)、雙酚 F－雙 －(3－氯 －2－羥丙基)甘油醚(BFDGE－2HCl);乙腈、甲醇、甲酸，均為色譜純;實驗用水經Millipore系統處理的超純水。

1.2 標準溶液的配制 稱取適量標準品(精確至0.001 g)，分別用甲醇溶解配制濃度為1.0 mg/mL的標準儲備液，保存于2～4℃冰箱內，有效期6個月。用50%甲醇水溶液將各標準儲備液稀釋成BPA、BPF、BPS、BADGE·HCl、BADGE·2HCl、BADGE·H2O·HCl、BFDGE、BFDGE·2H2O、BFDGE·2HCl 為5.0 μg/mL;BADGE、BADGE·H2O、BADGE·2H2O 為100.0μg/mL的混合標準工作溶液，保存于2～4℃冰箱內，現用現配。

1.3 樣品前處理 固體或粉狀樣品稱取0.5 g，加入2 mL水混勻，加入10 mL乙腈、2 mL 200 g/L乙酸鉛、2.0 g氯化鈉(膠囊類產品直接稱取0.5 g內容物后，加入 10 mL乙腈)，振蕩 5 min，8 000 r/min離心2 min，收集上清液;向下層殘渣中加入10 mL乙腈，按照步驟重復提取一次，合并上清液;將上清液在35℃水浴下減壓蒸干，加入5 mL水，混勻，取1 mL待凈化。分別加入3 mL乙酸乙酯、3 mL甲醇、3 mL水，活化SPE小柱，棄去流出液，將待凈化液加入柱中，棄去流出液，向柱中加入3 mL 20%甲醇水，棄去流出液，抽干小柱，向柱中加入5 mL甲醇∶乙酸乙酯(1∶2)，收集洗脫液，在40℃下氮吹至干，用50%甲醇水定容至1 mL，過0.22μm濾膜，供HPLC分析。

1.4 液相色譜條件 Platisil PH(反相色譜苯基柱)，250 mm×4.6 mm，5μm。流動相A為水，流動相B為乙腈;流速1.0 mL/min;進樣量20μL;柱溫30℃;激發波長:227 nm;發射波長:313 nm。梯度洗脫:0～10 min，60%A;10～27 min，60% ～40%;27 ～30 min，40% ～60%;30～75 min，60%。

2 結果與討論

2.1 液相色譜條件的優化

2.1.1 色譜柱的選擇: 選擇Platisil PH柱是因為與C8、C18類型的色譜柱比較后發現，其疏水性較弱于其他兩個類型的色譜柱，且表面含有的苯基基團與含苯基化合物容易發生π-π相互作用，對于雙酚類化合物具有獨特的選擇性。另外，表面的高密度鍵合和獨有的封端技術，增強了柱子的穩定性。經過實驗發現對12種雙酚類化合物都能做到基線分離且穩定性良好，12種標準品的色譜圖如圖1所示。

圖1 12種標準品的HPLC色譜圖

2.1.2 流動相及洗脫條件的選擇: 分別考察了甲醇—水和乙腈—水的流動相系統對于目標化合物分離程度的影響。以乙腈為有機相時12種目標物響應值比較穩定，分離度能夠達到方法學要求;而以甲醇為有機相時多個目標物的相應值明顯降低，無法滿足基線分離的要求。除考察流動相組成外，還比較了流動相梯度變化對化合物分離程度及峰型的影響。實驗中發現在27 min后必須通過降低有機相比例，使試樣中的雜質峰對前面的目標化合物的分離度及峰型的影響降低，特別是對于油脂含量較高的樣品。

2.2 前處理條件的優化

2.2.1 提取液的優化: 根據雙酚類化合物易溶于乙腈、丙酮、甲醇等有機溶液的特性，比較了甲醇和乙腈兩種試劑對保健品中雙酚類化合物的提取效果。如圖2所示，乙腈可以從基質中充分提取目標化合物，故而最終選擇乙腈溶液作為提取溶液。同時對于蛋白粉等固體保健食品，需要用水溶解樣品，在氯化鈉存在下采用乙腈提取，利用乙腈與鹽飽和水溶液分層的特性，充分提取化合物及除掉水溶性雜質。對于膠囊油類樣品，采用有機溶劑直接提取，乙腈與油類樣品可完全乳化，可充分提取樣品中目標化合物。

圖2 使用不同提取溶劑的前處理方法對目標化合物回收率的影響

2.2.2 固相萃取柱的選擇: 固相萃取法因其操作步驟簡單，溶劑用量少，提取效率高的特點被廣泛應用于樣品的前處理過程中，根據雙酚類化合物的特點，常用的固相萃取柱有C18柱、HLB柱、活性炭柱等。保健食品因為產品類型多，基質比較復雜，為了能夠找到同時滿足膠囊類、口服液類、固體粉劑類3種基質提取凈化要求的固相萃取柱，分別比較了C18柱、HLB柱、活性炭CARB柱的凈化效果。經過對3種基質的加標回收試驗發現，C18柱對于口服液類樣品的提取效果明顯，但是油脂含量較高的樣品例如膠囊類產品的提取效果不好;HLB柱屬于反向吸附劑，因其兼具親水基團和疏水基團，對極性和非極性的化合物都有很好的保留效果，但是對BADGE物質出峰位置有雜質峰干擾，影響結果分析。CARB小柱可吸附具有平面結構的色素、芳香烴等物質，經CARB處理后的樣品，BADGE出峰位置雜質峰明顯減少，且3種基質的樣品的回收率均滿足實驗要求，故最終選擇石墨化炭黑型ProElutCARB固相萃取柱。如圖3中所示為膠囊類樣品中添加BADGE、BADGE-H2O、BADGE-2H2O 3種化合物1.0 mg/kg、BPA、BPF、BPS、BADGE·HCl、BADGE·2HCl、BADGE·H2O·HCl、BFDGE、BFDGE·2 H2O、BFDGE·2HCl 9種0.05 mg/kg的色譜圖，27 min之后的4 個化合物 BPS、BFDGE、BADGE －2HCl、BADGE-HCl，能夠達到基線分離的要求。

圖 3 膠囊類保健品(BPA、BPF、BPS、BADGE·HCl、BADGE·2HCl、BADGE·H2O·HCl、BFDGE、BFDGE·2H2O、BFDGE·2HCl 9 種0.05 mg/kg;BADGE、BADGE·H2 O、BADGE·2H2 O 3 種 1.0 mg/kg)添加回收色譜圖

2.3 方法學驗證

2.3.1 檢出限(LOD)和定量線(LOQ): 空白基質溶液中加入系列混合標準溶液，以峰面積對應的濃度作圖。表1結果表明，12種化合物在各自的范圍內線性關系良好，相關系數(r)均＞0.999。分別以3倍信噪比(S/N＞3)和10倍信噪比(S/N＞10)計算得到12種雙酚類化合物的檢出限(LOD)及定量限(LOQ)分別為0.02～0.3 mg/kg及0.05～1.0 mg/kg。12種雙酚類化合物的相關系數、線性范圍及檢出限見表1，標準品色譜圖見圖1。

表1 12種雙酚類化合物的線性范圍、相關系數、檢出限及定量限

表2 4種基質中雙酚類添加回收率范圍

2.3.2 準確度與精密度:選擇4種不含雙酚類的樣品類型(魚油膠囊、膠原蛋白口服液、維生素片、乳基蛋白粉)進行加標回收率實驗，添加12種雙酚類標準品，進行3個水平的標準添加回收實驗。根據現行的歐盟法規要求確定了 BADGE、BADGE·H2O、BADGE·2H2O 3種化合物的添加水平為1.0、2.0和20 mg/kg，其他9種化合物的添加水平為0.05、0.1和1.0 mg/kg［2］。3個水平的平均回收率在71.3% ～118%(n=6)之間，相對標準偏差(RSD)為4.6% ～12.8%(n=6)，方法的回收率和精密度良好(表2)。

2.3.3 實際樣品檢測 采用本方法對市場上購買的口服液、膠囊和粉狀等3種不同類型基質共計37個保健食品進行檢測。在1個膠囊類的保健品中檢出BPA、BADGE·2HCl殘留，含量分別為0.08 mg/kg和0.12 mg/kg，說明雙酚類化合物有存在通過食品包裝材料遷移到保健品中風險，但含量較低，未超過雙酚類化合物的遷移總量要求。

3 結論

本文建立了固相萃取/高效液相色譜法同時測定保健食品中12種雙酚類化合物的遷移量方法。方法的定量限(LOQ)為0.05～1.0 mg/kg。方法操作簡單、快速、靈敏度高、重現性好，滿足現行法規要求的同時，可實現保健食品中雙酚類化合物遷移量的快速檢測。

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