干燥方式對鼠李糖乳桿菌微膠囊的活力及儲藏穩定性的影響

李佳君，劉璐，李曉東

（1.黑龍江省搖籃乳業股份有限公司，哈爾濱150010；2.東北農業大學食品學院，哈爾濱150030）

干燥方式對鼠李糖乳桿菌微膠囊的活力及儲藏穩定性的影響

李佳君1，劉璐2，李曉東2

（1.黑龍江省搖籃乳業股份有限公司，哈爾濱150010；2.東北農業大學食品學院，哈爾濱150030）

為了提高鼠李糖乳桿菌在人體胃腸道傳遞中的活力，以乳清蛋白和低聚異麥芽糖美拉德反應產物為壁材，通過內源乳化冷凝膠方法制作出微膠囊，研究不同干燥方式微膠囊儲藏穩定性。研究結果表明：美拉德產物壁材組微觀結構更光滑，無縫隙、破裂現象。乳清蛋白與低聚異麥芽糖混合壁材組和美拉德產物壁材組微膠囊經噴霧干燥菌活力下降3.26 g-1和3.15 g-1（對數值），4℃冷藏儲藏30 d后微膠囊菌活力分別為6.23 g-1和6.61 g-1（對數值），而冷凍干燥菌活力損失為1.62 g-1和1.51g-1（對數值），4℃冷藏儲藏30 d兩種壁材微膠囊菌活力分別為7.31 g-1和8.26 g-1（對數值）。美拉德產物壁材微膠囊冷凍干燥后水活度較低，擁有較好的儲藏穩定性。

干燥方式；美拉德反應；微膠囊；鼠李糖乳桿菌；活力

0 引言

益生菌具有多種生理功能[1,2]，但其活力容易受到不利環境的影響。研究者通常采用微膠囊法保證益生菌的活力[3]。乳清蛋白是一種常用的壁材，具有良好緩沖能力[4]。目前已有研究表明美拉德反應可以提高蛋白質抗氧化性、乳化性和抗過敏性等[5,6]且乳清蛋白美拉德產物作為壁材對活性物質具有良好的包埋效果[7,8]。目前，微膠囊制備通常采用噴霧干燥[9,10]和冷凍干燥。噴霧干燥法具有省時、易操作、可大規模生產等優點；冷凍干燥法可以有效保留原料中的活性物質[11-12]。

本研究將乳清蛋白與低聚異麥芽糖（IMO）的混合溶液（WIMIX）、乳清蛋白與IMO的美拉德反應產物（WIMRPs）作為壁材包埋鼠李糖乳桿菌，比較噴霧干燥和冷凍干燥對微膠囊儲存性及益生菌活力的影響。

1 實驗

1.1 材料

乳清蛋白（WPC-80），低聚異麥芽糖；鼠李糖乳桿菌6134等。

1.2 儀器與設備

ULTRA-TURRAX T8均質機，VD-1320超凈工作臺，DH5000A電熱恒溫培養箱，SYQ-DSX-280B手提式蒸汽滅菌鍋，BCKMAN Allegra 64R離心機，Leica DM2000顯微鏡，DHG-9240A電熱恒溫鼓風干燥箱，HZQ-X100振蕩培養箱，B-290噴霧干燥器，YB-FD-12冷凍干燥機等。

1.3 方法

1.3.1 內源乳化冷凝膠法制備鼠李糖乳桿菌微膠囊

通過前期實驗[13]驗證優化后美拉德反應產物作為益生菌微膠囊壁材具有較好的性能，本研究選擇兩組壁材，對照組為混合組(WIMIX)，質量分數為10%乳清蛋白90℃加熱2.5 h后加入1/4質量的低聚異麥芽糖；實驗組為乳清蛋白與低聚異麥芽糖美拉德反應產物組（WIMRPs），質量分數為10%乳清蛋白加入1/4質量的低聚異麥芽糖，加熱溫度90℃，加熱時間2.5 h。

微膠囊的制備按照Sadeghi等[14]的方法，并在此基礎上進行部分調整：取不同條件的壁材溶液20 mL，將鼠李糖乳桿菌濃縮液與壁材溶液比例（菌膠比）為1∶10，混合均勻，加入質量濃度為0.35 g/L葡萄酸內酯（GDL），濃度為0.1 mol/L的CaCl2后立即加入到5倍豆油的三角瓶中，放在磁力攪拌器，轉速為900 r/min，40℃，恒溫加熱2 h，使其充分凝膠形成微膠囊。將微膠囊和油混合液分離，采用離心機分離，5 000 g，5 min。

1.3.2 干燥方式對鼠李糖乳桿菌微膠囊活性的影響

（1）冷凍干燥法制作鼠李糖乳桿菌微膠囊。將上述乳化凝膠法得到的濕益生菌微膠囊放入平皿中放入-20℃冰箱中預凍12 h，然后將平皿放入凍干機，凍干溫度設置為-50℃，凍干真空度為5.0 Pa，冷凍干燥16 h后得到微膠囊凍干品。

（2）噴霧干燥法制作鼠李糖乳桿菌微膠囊。取保藏菌種活化3代，接種于MRS瓊脂平板上，37℃厭氧培養48 h。挑取新鮮單菌落接種于1 000 mL液體MRS基中，37℃靜置培養48 h。4℃，6 000 g離心5 min，適量生理鹽水清洗離心3次獲得菌泥，加入適量生理鹽水制成菌懸液，備用。將壁材溶液與濃縮菌液按照體積（10∶1）充分混合，將此混合液進行噴霧干燥，噴霧干燥的工藝參數進風溫度160℃，泵速15 mL/min。收集噴霧干燥器的底部微膠囊粉末。

（3）干燥方式對鼠李糖乳桿菌微膠囊活性影響。準確稱取0.5 g微膠囊干燥樣品，加入到4.5 mL生理鹽水中。微膠囊菌活力計算，參照Reid等[15]機械破碎法略有改動，取過濾得到微膠囊0.5 g，加入4.5 mL濃度為50 mmol/L的檸檬酸鈉溶液，在均質機轉速為10 000 r/min（45 s），打破微膠囊釋放鼠李糖乳桿菌。連續10倍稀釋，取100 μL涂布平板法培養48 h，計算活菌數。

1.3.3 干燥方式對鼠李糖乳桿菌微膠囊微觀結構的影響

將干燥后的微膠囊置于玻璃皿內，用質量分數為1.0%的四氧化鋨氣體固定，用雙面膠將其粘在樣品臺上，離子濺射后用掃描電鏡觀察微膠囊表面結構，加速電壓5.0 kV。

1.3.4 干燥方式對鼠李糖乳桿菌微膠囊儲藏穩定性的影響

（1）鼠李糖乳桿菌微膠囊水分活度測定。取少量干燥后的微膠囊粉末，放置于快速水分活度儀中，在25℃下測定微膠囊的水分活度。

（2）鼠李糖乳桿菌微膠囊冷藏穩定性測定。將干燥后的微膠囊放置于無菌的西林瓶中，封口后將西林瓶放置于4℃冷藏1個月，每隔15 d從西林瓶中取出0.5 g樣品，加入到4.5 mL生理鹽水中，充分復水后，參照1.3.2（3）中方法對微膠囊中的活菌數進行計數。

1.3.5 數據統計分析

每個實驗重復3次，結果表示為平均數(Mean)± SD。數據統計分析采用Statistix 8.1(分析軟件,St Paul,MN)軟件包中Linear Models程序進行，差異顯著性(P＜0.05)分析使用Tukey HSD程序。采用Sigma?plot11.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 干燥方式對鼠李糖乳桿菌微膠囊菌活力的影響

干燥方式對益生菌微膠囊活力影響顯著，其中冷凍干燥的低溫和噴霧干燥較高的進風溫度是對益生菌微膠囊產品活性影響最大的因素。本研究選取兩種干燥具體工藝參數，充分考慮了益生菌微膠囊的活性和產量，以及益生菌微膠囊的水分質量分數及貯存穩定性（圖1）。

圖1 兩種干燥方法對微膠囊菌活力的影響

由圖1可以看出，采用凍干方法制備的WIMRPs微膠囊存活量（對數值）從9.55 g-1下降到7.91 g-1。WIMIX微膠囊從9.57g-1下降到7.57g-1（對數值，下同）。采用噴霧干燥方法制備的WIMRPs微膠囊中菌活力的從10.54 g-1下降到7.27g-1（對數值）。WIMIX微膠囊從10.32 g-1下降到7.06 g-1（對數值）。WIM?RPs微膠囊通過冷凍干燥方法使菌活力下降了1.6個對數值，而噴霧干燥使菌活力下降3個對數值。這是由于鼠李糖乳桿菌對高溫比較敏感，雖然噴霧干燥很短時間內蒸發水分帶走大部分熱能，但剩余的熱量也會造成菌活力大量損失。進風溫度過高會使菌活性迅速下降，本研究選擇160℃時水分的蒸發速度慢，為了減少產品水活度，采用減少進料量，使液滴表面水分散失加快，成膜速度提高。但進料量降低可能使微膠囊在儀器內停留時間延長，造成活力下降。冷凍干燥下真空去除水分，此過程中壁材中低聚異麥芽糖可能起到兩個作用，隨著水分損失，可能造成糖濃度上升，使菌細胞內外滲透壓過大，活力降低。另外，糖內羥基可以取代水分子與菌體中某些成分結合形成氫鍵，在冷凍干燥過程保護細胞膜和胞內蛋白中免受損傷[16]，低聚異麥芽糖可能充當凍干保護劑，減少菌體在低溫下活力的損失。

2.2 干燥方式對鼠李糖乳桿菌微膠囊微觀結構的影響

2.2.1 噴霧干燥法制備鼠李糖乳桿菌微膠囊電鏡圖

一般只能通過進風溫度、進料速度和出風溫度來控制噴霧干燥過程。進風溫度雖然很高，但進料霧化后水分在極短時間內吸熱蒸發，使溫度迅速降低，出風溫度實際代表著噴霧干燥器內的整體溫度，即微膠囊顆粒實際所處的溫度。本研究所采用的實驗室用小型噴霧干燥器，不能調節出風溫度，必須用進風溫度及速度和進樣流量共同調節。進風溫度過高容易造成微膠囊表面開裂，導致包埋效率和產率下降，但進風溫度過低，造成產品水分含量過高嚴重粘壁影響微膠囊收集和分散。此外，由于本研究芯材采用鼠李糖乳桿菌，應用噴霧干燥法應考慮包埋產率和菌體存活率兩方面。從生物學角度看，噴霧干燥參數確定對益生菌微膠囊內菌活力影響是非常大的。本研究結合實際試驗情況將噴霧干燥器參數定為進風溫度160℃，泵速15 mL/min，調節風速控制出口溫度約80℃。將兩種壁材經噴霧干燥法制得的微膠囊在掃描電鏡下放大1 000，2 000，5 000倍觀察微膠囊的微觀結構，如圖2所示。

圖2 噴霧干燥微膠囊掃描電鏡圖

將壁材溶液與菌液混合經噴霧干燥霧化后，霧滴表面是壁材液體，益生菌會處于霧滴內部，這種微膠囊顆粒為表面略有塌凹的球形。這些表面凹陷是噴霧干燥微膠囊產品具有的普遍特征[17]。由圖2可以看出，WIMIX和WIMRPs壁材微膠囊外觀形態均為圓形，并且分散性較好。圖2（a）中，WIMIX壁材微膠囊微觀結構有噴霧干燥典型的凹陷，部分表面是非連續，有裂縫和孔隙。圖2（b）與圖2（a）比較，顆粒表面光滑，產品顆粒較圓整，呈球形，未見縫隙和破裂，表明有較包埋效果較好，但是表面有一些小凹坑，這種現象是噴霧干燥過程的冷卻階段，由于高速率噴霧，壁材固化比熱氣流造成的微膠囊膨脹要早，壁材皺縮造成表面凹陷。噴霧干燥過程中，隨著物料中水分的蒸發，這些多支鏈結構的分子在細菌的周圍交織結合形成一層層的囊膜，將細菌包裹起來，使其在熱風中能夠存活下來。但由于乳清蛋白分子間與美拉德反應產物分子間的結合作用力不同，形成微膠囊厚度不同，所以微觀結構有所差異。從表面結構來看，WIMRPs組與WIMIX組比較更適于作為益生菌微膠囊壁材。

2.2.2 冷凍干燥法制備鼠李糖乳桿菌微膠囊電鏡圖

真空冷凍干燥特別適合干燥熱敏性和極易氧化的食品物料，能較大限度保留食品中活性成分及營養成分。在冷凍干燥過程中受到冷凍和干燥兩種因素的作用，導致益生菌活力下降。低溫作用使益生菌內外產生的冰晶會對細胞造成機械損傷；而干燥作用，細胞膜結構、性質改變導致滲透性損傷。本研究將內源乳化法制作的益生菌微膠囊預凍后，真空冷凍干燥參數為溫度-50℃，真空度為5.0 Pa，冷凍干燥16 h后得到微膠囊。將兩種壁材凍干微膠囊在掃描電鏡下放大1 000，2 000，5 000倍觀察微膠囊的微觀結構，如圖3所示。

圖3 冷凍干燥后微膠囊的掃描電鏡觀察結果

由圖3可以看出，兩種壁材微膠囊在冷凍干燥后均存在聚集現象，隨處可見型狀不規則的聚集體。乳清蛋白益生菌微膠囊在凍干后的這種聚集現象已經許多文獻所報道，這是由本身的柔軟性和易脆性所致。兩種壁材表面都較光滑，可能是由于低聚異麥芽糖加入能保留住一些水分子以抵抗表面壓力，形成較均一光滑的外壁。美拉德反應產物壁材微膠囊凍干后的微觀的結構(圖3b)和混合組(圖3a)有明顯的不同，美拉德反應產物壁材微膠囊單體表面較光滑，表面致密，結構緊實。WIMIX壁材微膠囊雖然表面也很光滑，但存在有一些的塌陷現象，是由于冷凍干燥過程中水分流失造成[18]。由于蛋白與糖交聯形成的聚合物在干燥過程中結構更加穩定，不容易發生形變，因此冷凍干燥WIMRPs微膠囊擁有更光滑的外表。

2.3 干燥方式鼠李糖乳桿菌微膠囊冷藏穩定性測定

2.3.1 對鼠李糖乳桿菌微膠囊水分活度

包埋方法對微膠囊的水分活度有顯著的影響，本研究的方法分別測定了微膠囊的水分活度，結果如表1所示。冷凍干燥水分活度顯著低于噴霧干燥（P＜0.5），同種干燥方法兩種壁材水分活度差異不明顯（P＞0.5）。Chávez等[19]研究發現益生菌儲藏的最高安全水分活度為0.25。本研究涉及此范圍內的只有冷凍干燥的WIMRPs微膠囊。低聚異麥芽糖的吸濕性可能是引起的水分活度輕微升高的原因。

表1 兩種包埋方法的水分活度

2.3.2 對鼠李糖乳桿菌微膠囊儲藏穩定性的影響

檢驗兩種壁材及干燥方法制作出的微膠囊的儲藏穩定性。本研究將兩種壁材不同方法制作的干微膠囊放在4℃冷藏保存，分別在15 d和30 d取樣，檢測其微膠囊中菌的活力。結果如圖4所示。

圖4 微膠囊在4℃條件下儲藏穩定性

在4℃冷藏儲藏30 d后發現，所有微膠囊中的菌活力都有不同程度的下降，兩種壁材微膠囊中鼠李糖乳桿菌的存活量都顯著下降（P＜0.05），采用冷凍干燥制得美拉德產物壁材微膠囊存活量（對數值）從8.57 g-1下降到8.16 g-1，混合組的從8.30 g-1下降到7.31 g-1（對數值，下同）。采用噴霧干燥制得美拉德產物壁材微膠囊存活量從7.15 g-1下降到6.62 g-1（對數值），混合組從7.22 g-1下降到6.25 g-1（對數值）。結果顯示美拉德產物壁材微膠囊經冷凍干燥有更好的儲藏穩定性。

Sandra等[20]將大米淀粉和菊粉混合經噴霧干燥法包埋鼠李糖乳桿菌制成微膠囊，結果發現菊粉作為益生元能提高菌在存儲期的活力。Vodnar等[21]將干酪乳桿菌、植物乳桿菌加入質量分數為2%的富硒綠茶提取物（益生元）制作微膠囊，發現能顯著提高30天冷藏溫度下的儲藏穩定性。這主要是小分子糖對細胞壁具有穩定作用，升高壁材玻璃化轉變溫度將有利于提高益生菌在儲藏過程中的穩定性[22]。美拉德反應產物具有清除氧和降低氧化還原電勢的作用[23]，為厭氧或微好養的益生菌細胞提供一個適宜的儲藏環境，而且美拉德產物凍干組具有較低的水分活度，一般，水分活度低有利于益生菌的儲藏。在4℃冷藏儲藏條件下，美拉德反應產物為壁材的微膠囊比混合組微膠囊具有較好的儲藏穩定性，儲藏期間給鼠李糖乳桿菌帶來更好的保護。

微膠囊壁的完整性從側面反映微膠囊對益生菌的包埋率和保護能力，通過觀察兩種壁材制作微膠囊微觀結構，發現美拉德產物壁材微膠囊表面更光滑，經冷凍干燥后微膠囊水分活度更適合微膠囊的儲藏，且在4℃儲藏30 d后活力能保持在8.0 g-1（對數值）以上。

3 結論

本研究將混合組和美拉德產物壁材組經冷凍干燥和噴霧干燥兩種方式制成干微膠囊，并對微觀結構進行了對比，發現噴霧干燥法制備美拉德產物壁材微膠囊顆粒噴霧干燥具有特征表面略有塌凹的球形，分散性較好。冷凍干燥美拉德產物壁材微膠囊表現為不規則的聚集體，其單體表面較光滑，表面致密，結構緊實。從鼠李糖乳桿菌微膠囊儲藏活性來看冷凍干燥優于噴霧干燥法，美拉德產物壁材微膠囊儲藏期穩定性好于混合壁材。通過對比冷凍干燥和噴霧干燥兩種干燥方式對乳清蛋白與低聚異麥芽糖混合壁材與美拉德產物壁材微膠囊儲藏對鼠李糖乳桿菌活力的影響，發現冷凍干燥乳清蛋白與低聚異麥芽糖壁材微膠囊經儲藏后有更高的菌活力。

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Effects of encapsulation methods on vitality of L.rhamnosus microcapsules during storage

LI Jiajun1,LIU Lu2,LI Xiaodong2
(1Heilongjiang Yaolan Dairy Technology Stock Company Ltd,Harbin,150010,China, 2.College of Food Science,Northeast Agricultural University,Harbin,150030,China)

In order to improve the viability of Lactobacillus rhamnosus(L.rhamnosus)in the human gastrointestinal tract,L.rhamnosus was en?capsulated in whey protein/Isomaltooligosaccharide Maillard reaction products（WIMRPs）microspheres prepared by internal emulsifica?tion technique coupled with cold gelation process.The effects of encapsulation methods on vitality of L.rhamnosus microcapsules during storage was studied.The results showed that microcapsules using Maillard reaction products were smooth,seamless and non-cracking.The vitalities of bacteria encapsulated in mixture of whey protein/isomaltooligosaccharide and Maillard reaction products after spray drying were 3.26 log CFU/g,3.15 log CFU/g,respectively.While the vitalities of bacteria encapsulated in mixture of whey protein-isomaltooligosaccharide and Maillard reaction products after freeze-drying were 1.62 log CFU/g,1.51 log CFU/g,respectively.The vitalities encapsulated in mixture of whey protein/isomaltooligosaccharide and Maillard reaction products were 6.23 log CFU/g,6.61 log CFU/g in freeze-drying and 8.26 log CFU/g,7.31 log CFU/g in spray drying after refrigerated for 30 days.Aw of microcapsules using Maillard reaction products reduced after freeze-drying.Maillard reaction products had better stability of storage as wall material.

encapsulation methods;Maillard reaction;L.rhamnosus microcapsules;probiotic;viability

TS201.3

：A

：1001-2230（2017）03-0021-05

2016-08-30

黑龍江省教育廳面上項目(12541027)。

李佳君(1963-)，女，高級工程師，從事乳品方面的研究與開發。

李曉東