KIR-HLA基因多態性與散發性急性戊型肝炎的關系

陳 沖， 章樹業， 荀靜娜， 張玉玲， 李微霞， 盧 川， 陳 良

(1 溫州醫科大學， 浙江 溫州 325000； 2 復旦大學附屬上海市公共衛生臨床中心， 上海 201508)

KIR-HLA基因多態性與散發性急性戊型肝炎的關系

陳 沖1,2， 章樹業2， 荀靜娜2， 張玉玲2， 李微霞2， 盧 川2， 陳 良1,2

(1 溫州醫科大學， 浙江 溫州 325000； 2 復旦大學附屬上海市公共衛生臨床中心， 上海 201508)

目的 探討殺傷性免疫球蛋白樣受體(KIR)及其配體人類白細胞抗原(HLA)的基因多態性與散發性急性戊型肝炎(AHE)的相關性。方法 收集2015年8月-2016年9月期間于復旦大學附屬公共衛生臨床中心肝炎一科住院的AHE患者42例，另招募健康受試者30例作為對照組。提取入組對象外周血基因組DNA，采用序列特異性引物PCR法擴增KIR基因，并利用Sanger測序法對HLA進行基因分型，分析KIR-HLA分布與散發性AHE的關系。計數資料組間比較采用χ2檢驗。結果 兩組均可檢測到16種KIR基因(包括抑制型受體基因2DL1-3、2DL5、3DL1-3，激活型受體基因2DS1-5、3DS1，較特殊的抑制型/激活型受體基因2DL4，內參基因DRB1及假基因2DP1)，同時HLA-B(包括HLA-Bw4、HLA-Bw6、HLA-Bw4/Bw6)、HLA-C(包括HLA-C1/C1、HLA-C1/C2、HLA-C2/C2)亦可檢測。AHE患者中抑制型基因KIR 2DL3/2DL5/3DL2/3DL3出現的頻率顯著低于對照組(64.3% vs 93.3%,P<0.05; 23.8% vs 56.7%,P<0.05; 71.4% vs 100%,P<0.05; 69.0% vs 100%,P<0.05)；AHE患者HLA-C1/C2和3DL1/HLA-Bw4基因的出現頻率低于對照組(19.0% vs 40.0%,P<0.05；45.2% vs 73.3%,P<0.05)；另外，AHE患者中HLA-C1/C1基因出現的頻率高于對照組(71.4% vs 46.7%,P<0.05)。結論 抑制型基因KIR 2DL3/2DL5/3DL2/3DL3，HLA-C1/C1、C1/C2和3DL1/HLA-Bw4的基因分布差異可能與HEV感染導致散發性AHE有一定關系。

肝炎, 戊型； 多態性, 單核苷酸； 受體, 自然殺傷細胞； HLA抗原； 基因型

急性戊型肝炎(acute hepatitis E，AHE)是由HEV感染引起的急性自限性疾病，主要通過被污染的水和食物經消化道傳播。全球既往HEV感染率為8%～20%[1-2]，但感染發病群體僅占既往感染者非常小的一部分，大多數HEV感染者并未表現出急性肝炎癥狀[3]，其自身機體是否存在某些免疫學特征導致急性肝炎的發生有待進一步研究。

自然殺傷細胞(NK細胞)為天然免疫系統的關鍵組成部分，也是獲得性細胞免疫的核心調節細胞，其可產生細胞因子和發揮細胞毒性作用，在感染的早期控制病毒使其感染局限，亦可介導獲得性免疫反應[4]。NK細胞的激活是一個復雜的平衡過程，有賴于細胞表面激活與抑制相關受體之間相互調節，殺傷性免疫球蛋白樣受體(killer cell immunoglobulin-like receptors,KIR)作為NK細胞主要受體之一，在參與調節NK細胞功能方面起著非常重要的作用，與KIR結合的配體主要是人類白細胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)，多種抑制型和活化型KIR與HLA結合，傳遞抑制或激活信號，調節NK細胞的活性[5]。近年來KIR基因多態性與病毒感染免疫相關的報道日益增多，包括HIV、HBV、HCV、EB病毒等[6]，然而HEV與KIR-HLA基因多態性的研究則較少報道，本研究旨在探討KIR-HLA基因多態性與散發性AHE的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2015年8月-2016年9月于復旦大學附屬公共衛生臨床中心肝炎一科住院的AHE患者42例，其中男31例，女11例，年齡24～49歲，平均32歲。診斷標準：肝酶升高，血清膽紅素升高以及ELISA測定抗-HEV IgM陽性。另招募健康志愿者30例，其中男21例，女9例，年齡25～43歲，平均30歲。本研究患者及健康志愿者均簽署知情同意書。

1.2 樣本采集 留取AHE患者及健康志愿者靜脈血5 ml，于-80 ℃保存待測。

1.3 主要試劑和儀器 血液基因組DNA小量提取試劑盒(DK601，上海萊楓生物科技有限公司)，PCR擴增儀(DYQ6072，杭州博日科技有限公司)，水平電泳儀(DYY-6D型，北京六一生物科技有限公司)，紫外/凝膠成像系統(NJ-206，上海馳唐儀器)，3730XL自動測序儀(Applied Biosystems, 美國)。

1.4 檢測方法

1.4.1 外周血基因組DNA提取 血液樣本在室溫25 ℃解凍，采用細胞裂解法從全血中快速提取樣本的基因組DNA。

1.4.2 KIR基因分型 采用序列特異性引物PCR法擴增目的片段。特異性引物設計參考文獻[7](引物由蘇州金唯智公司合成)，PCR試劑盒(TaKaRa公司)程序設置：94 ℃ 3 min；5個循環：94 ℃ 15 s，65 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s；21個循環：94 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s；4個循環：94 ℃ 15 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min；72 ℃ 7 min。擴增后產物經由3%瓊脂糖凝膠電泳，然后在紫外/凝膠成像系統掃描成像，根據條帶結果判定相應的基因。KIR的AA或Bx單倍體判別在http://www.allelefrequencies.net/kir6001a/asp中進行比對。

1.4.3 HLA基因分型 3730XL自動測序儀分析HLA基因分型，將特定的熒光標記在引物上配制反應Mix，并設置陰性對照，通過PCR產物的長度大小檢測基因。HLA-B和C型單倍體的確定在SBTengine 3.10.0.2610軟件中分析得到。比較兩組KIR基因位點的基因頻率有無差異，KIR基因表型頻率的計算采用陽性頻數計算法。

1.5 統計學方法 采用SPSS18.0統計軟件進行數據分析。計數資料組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組KIR及HLA基因分型頻率 兩組均可檢測到16種KIR基因(包括抑制型受體基因2DL1-3、2DL5、3DL1-3，激活型受體基因2DS1-5、3DS1，較特殊的抑制型/激活型受體基因2DL4，內參基因DRB1及假基因2DP1)(表1)，同時HLA-B(包括HLA-Bw4、HLA-Bw6、HLA-Bw4/Bw6)、HLA-C(包括HLA-C1/C1、HLA-C1/C2、HLA-C2/C2)亦可檢測(表2)。健康志愿者的假基因2DP1以及大部分基因片段2DL1/2DL3/2DL5/3DL1/3DL2/3DL3/2DS1/2DS2/2DS3/2DS4/2DS5/3DS1與我國人群KIR相關分型頻率相對一致，但部分基因的出現頻率如2DL2/2DL4存在較大范圍的偏離。AHE患者中抑制型基因KIR 2DL3/2DL5/3DL2/3DL3出現的頻率顯著低于健康對照組(64.3% vs 93.3%,P<0.05; 23.8% vs 56.7%,P<0.05; 71.4% vs 100%,P<0.05; 69.0% vs 100%,P<0.05)(表1)。

2.2 AHE與健康對照組KIR-HLA配體組合比較 AHE患者HLA-C1/C1基因出現頻率高于健康對照組(P=0.034)；HLA-C1/C2和3DL1/HLA-Bw4基因出現頻率低于健康對照組(P值分別為0.031、0.018)。其余KIR基因位點基因及配體結合頻率差異均無統計學意義(P值均>0.05)(表2)。

表1 兩組KIR基因表達頻率比較[例(%)]

注：OR，比值比；95%CI，95%可信區間

3 討論

NK細胞的生物學效應受多種激活型與抑制型受體調控，表面受體KIR及其配體HLA的相互作用在調控NK細胞抵抗病毒感染的免疫功能上起著至關重要的作用[5-6]。HLA是人類主要組織相容性復合體 Ⅰ 類分子，其最著名的功能是遞呈胞內小肽給CD8+T淋巴細胞，而另一個作用則是作為KIR識別的受體。由于KIR基因的數量變異、序列多樣性、體內表達多樣以及KIR-HLA結合多態性，使得KIR-HLA系統復雜多變[8]，均可能影響HEV感染機體時的免疫反應。

本研究中KIR-HLA基因分析結果顯示，HLA-C1/C1與HLA-C1/C2在AHE患者中出現的頻率高于健康對照組，提示高表達的HLA-C可能與散發性AHE有一定關系。已有研究[9]表明，HLA-C基因的高表達有利于機體控制HIV感染，通過提高特異性T淋巴細胞對HIV的應答來減緩獲得性免疫缺陷綜合癥患者的病程進展，尤其是HLA-C1/C1與KIR 2DL3存在時，NK細胞分泌的干擾素會顯著增多，使機體抵抗病毒感染的能力增強。不僅如此，Khakoo等[10]對HCV感染者KIR-HLA基因組合進行分析，發現KIR 2DL3/HLA-C1基因組合有利于病毒的清除。以上研究的對象為HIV、HCV感染者，鑒于NK細胞在多種感染性疾病、腫瘤及自身免疫性疾病發病及進展等方面均有重要作用且機制復雜，所以即使在同一種族人群不同疾病背景的受試者中進行KIR-HLA分型也可能存在一定程度的差異。另外，本研究中AHE組的KIR 2DL3出現頻率顯著低于健康對照組，2DL3/HLA-C1的組合頻率低于健康對照組，盡管差異無顯著性，但仍具有一定的提示作用。既往已有研究[11]報道隨機人群KIR 2DL3陽性的NK細胞在抵御各種病毒感染的早期能夠分泌更多的干擾素γ，表現出更強的細胞脫顆粒作用，對感染的肝細胞具有直接的殺傷作用。

KIR 3DL1/HLA-B是最早被發現的具有高度多變性的受體-配體基因型，雖然既往報道[12]提示二者出現在全球人群的頻率接近100%，但隨著人類的進化，其演變出的基因亞型非常多。其中KIR 3DL1/HLA-Bw4不同亞型的特異性結合，不僅可表現出不同的受體-配體結合親和性，而且在機體應對感染功能方面存在差異。Boudreau等[13]的研究揭示了KIR 3DL1/HLA-Bw4基因表達的密度與結合力不同可以調節NK細胞抵抗HIV感染，證實其是HIV感染的保護性因素。本研究結果顯示，KIR 3DL1/HLA-Bw4在AHE組中的出現頻率較健康對照組低，提示若宿主為KIR 3DL1/HLA-Bw4基因型的表達者，AHE的患病幾率可有所減低。

本研究中AHE組KIR 2DL3/2DL5/3DL2/3DL3的頻率顯著低于對照組，KIR 2DL5基因編碼的胞漿區域可通過聚集Src同源區域編碼的酪氨酸磷酸酶來抑制NK細胞的活性[14]，但其與機體病毒感染的具體效應機制未見明確報道。雖已有研究[15]報道3DL2/3DL3異常頻率在強直性脊髓炎的慢性炎癥中充當一定的角色，但相關的病毒感染方面的報道并不多見，因此研究具有不同遺傳背景及不同臨床表型的HEV感染病例，可能會有新的發現。

值得注意的是，部分基因如2DL2/2DL4在本研究中的出現頻率有一定范圍的偏離，考慮到納入研究的隊列僅72例，可能是由于樣本量不足導致部分結果的偏差。一方面由于復旦大學附屬公共衛生臨床中心是一家傳染病專科醫療機構，該中心有3個肝病病區，未能將中心所有HEV感染者均納入研究；另一方面上海市是醫療衛生相對發達的城市，人群受不潔飲食感染的機會較其他地區小。但總體來說，筆者對KIR-HLA進行了比較全面的分析，采取目前國內外廣泛應用的PCR-SSP基因分型方法，實驗設計較為完整，排除了年齡及性別等混雜因素的干擾，得到相對客觀的實驗結果，揭示了散發性AHE與NK細胞KIR-HLA分型確實存在一定聯系。此外，本研究僅在宿主免疫非常小的一方面進行了研究分析，事實上KIR-HLA具有高度多態性，在不同地區、不同人種中的分布具有很大的差異，而且除KIR外，還有多種細胞表面抑制型、活化型受體及細胞因子參與噬肝病毒感染時NK細胞的免疫調節功能。例如，在慢性乙型肝炎中，IL-10即發揮負性調控NK細胞功能的作用，影響NK細胞的抗病毒能力[16]。因此，進一步多地區、大樣本及深層的免疫學研究了解NK細胞調節HEV感染的機制是非常必要的，這也將會為HEV感染的預防和治療提供相應的免疫學依據。

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引證本文：CHEN C, ZHANG SY, XUN JN, et al. Association between killer cell immunoglobulin-like receptor/human leukocyte antigen gene polymorphisms and sporadic acute hepatitis E[J]. J Clin Hepatol, 2017, 33(3): 462-465. (in Chinese)

陳沖， 章樹業， 荀靜娜， 等. KIR-HLA基因多態性與散發性急性戊型肝炎的關系[J]. 臨床肝膽病雜志, 2017, 33(3): 462-465.

(本文編輯：王 瑩)

Association between killer cell immunoglobulin-like receptor/human leukocyte antigen gene polymorphisms and sporadic acute hepatitis E

CHENChong,ZHANGShuye,XUNJingna,etal.

(WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou,Zhejiang325000,China)

Objective To investigate the association between killer cell immunoglobulin-like receptor (KIR)/human leukocyte antigen (HLA) gene polymorphisms and sporadic acute hepatitis E (AHE). Methods A total of 42 AHE patients who were hospitalized in First Department of Hepatitis, Public Health Clinical Center Affiliated to Fudan University, from August 2015 to September 2016 were enrolled, and 30 healthy subjects were enrolled as control group. Genomic DNA was extracted from the peripheral blood, and PCR/sequence specific primer was used for the amplification of KIR gene. Sanger sequencing was used to determine the genotype of HLA, and the association between KIR-HLA distribution and sporadic AHE was analyzed. The chi-square test was used for comparison of categorical data between groups. Results A total of 16 KIR genes were detected in each group, including inhibitory receptor genes 2DL1-3, 2DL5, and 3DL1-3, activating receptor genes 2DS1-5 and 3DS1, the special inhibitory/activating receptor gene 2DL4, internal reference gene DRB1, and pseudogene 2DP1, as well as HLA-B (including HLA-Bw4, HLA-Bw6, and HLA-Bw4/Bw6) and HLA-C (including HLA-C1/C1, HLA-C1/C2, and HLA-C2/C2), were also detected. Compared with the control group, the AHE group had significantly lower frequencies of inhibitory genes KIR 2DL3 (64.3% vs 93.3%,P<0.05), 2DL5 (23.8% vs 56.7%,P<0.05), 3DL2 (71.4% vs 100%,P<0.05), and 3DL3 (69.0% vs 100%,P<0.05), significantly lower frequencies of HLA-C1C2 (19.0% vs 40.0%,P<0.05) and 3DL1/HLA-Bw4 (45.2% vs 73.3%,P<0.05), and a significantly higher frequency of HLA-C1/C1 gene (71.4% vs 46.7%,P<0.05). Conclusion The difference in the distribution of inhibitory genes KIR 2DL3, 2DL5, 3DL2, and 3DL3, HLA-C1C1/C1C2, and 3DL1/HLA-Bw4 may be associated with sporadic AHE caused by hepatitis E virus infection.

hepatitis E； polymorphism, single nucleotide; receptors, natural killer cell； HLA antigens； genotype

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.03.013

2016-10-17；

2016-11-09。

國家重點基礎研究發展計劃“973計劃”(2015CB554303)；上海申康醫院發展中心市級醫院新興前沿技術聯合攻關項目(SHDC12015129)；上海市科委“科技創新行動計劃”醫學與農業領域重點項目(13401902100)

陳沖(1991-)，女，主要從事感染內科及病毒學方面的研究。

陳良，電子信箱:chenliang@shaphc.org。

R512.6

A

1001-5256(2017)03-0462-04