肝竇內皮細胞在肝纖維化發生發展中的機制及相關治療策略

杜艷芹， 吳 珺， 楊東亮

(華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院 感染科， 武漢 430022)

肝竇內皮細胞在肝纖維化發生發展中的機制及相關治療策略

杜艷芹， 吳 珺， 楊東亮

(華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院 感染科， 武漢 430022)

肝竇內皮細胞不僅是保護肝臟免受損傷的第一道防線，也在慢性肝損傷導致的纖維化和肝硬化中伴有重要角色。它主要通過介導肝臟炎癥反應、參與肝竇毛細血管化和血管再生、激活肝星狀細胞、分泌多種促炎細胞因子、參與細胞外基質生成以及介導肝臟微循環障礙等參與肝纖維化。闡明這些機制，有助于探索肝纖維化治療的新靶點和方案。

肝硬化； 肝竇內皮細胞； 治療

肝竇內皮細胞(liver sinusoidal endothelial cells, LSEC)構成了肝血竇的血管壁，是肝內非實質細胞的主要群體，約占肝非實質細胞的50%。已分化的LSEC電鏡下可見其特征性的窗孔結構，且窗孔內皮下缺乏完整的基膜，窗孔占據總表面積的6%～8%[1]，這種多孔性結構在肝實質細胞與血液物質交換中起著關鍵的作用。LSEC的另一個結構特點是胞質內含有大量的吞飲小泡，參與多種內源性和外源性顆粒及大分子物質的內吞攝取。LSEC也表達多種清道夫受體，參與大顆粒物質的清除，在Kupffer細胞缺乏或耗盡時，LSEC可直接吞噬并清除較大的顆粒。LSEC還具有合成Ⅳ型膠原及各種非膠原基質如纖維結合蛋白(FN)和層黏連蛋白(LN)的功能。此外，LSEC在肝內的免疫調節中也具有重要的作用。LSEC表達多種模式識別受體[2]，能識別并清除病原相關分子模式和宿主自身的損傷相關分子模式，參與天然免疫應答。LSEC還表達FcγRⅡb2，結合在IgG的Fc段，其在清除血液中的抗原與 IgG形成的小免疫復合物上具有重要作用。另外，LSEC組成性表達與專職抗原遞呈細胞相關的一系列表面分子，如主要組織相容性復合體(MHC)-Ⅰ類分子和MHC-Ⅱ類分子，CD54(ICAM), CD106(VCAM-1)和共刺激分子CD80、CD86和CD40[3]，可以通過抗原遞呈方式活化T、B淋巴細胞。在生理狀態下，LSEC通過一系列途徑如誘導調節性T淋巴細胞的分化、共抑制分子B7H1的高表達等維持肝內的免疫耐受。

由于其特殊的解剖位置，LSEC是保護肝臟免受損傷的第一道防線[4]，門靜脈系統帶來的、腸道吸收的各種物質首先作用于LSEC。LSEC持續的損傷和炎癥反應，通過一些機制導致肝星狀細胞(HSC)的激活、細胞外基質(ECM)生成和降解失衡等，促進肝纖維化的發生發展。本文簡要介紹LSEC在肝纖維化中發生發展的機制及其相關的可能治療策略。

1 LSEC參與肝纖維化形成

肝纖維化是肝內ECM成分過度沉積的一種傷口愈合反應。當肝損傷和炎癥持續存在時，肝臟不能正常再生并形成纖維性瘢痕，重者導致肝小葉結構重構、假小葉及結節形成，即肝硬化。在引起肝硬化的各種慢性肝病中，酒精性肝病和非酒精性脂肪肝為西方國家最常見的病因，而亞太地區最常見的肝硬化原因是病毒性肝炎，主要是乙型肝炎[5]。此外，其他許多疾病如藥物性肝損傷、自身免疫性肝病、遺傳性疾病如威爾遜病等也可導致肝纖維化。LSEC以多種機制參與肝內纖維化的形成。

1.1 LSEC表型變化并介導肝臟炎癥反應 研究[6]表明，正常和活化的LSEC均未見CD31、CD34、FVⅢ-RAg、E-選擇素和鈣黏蛋白5等常見的血管內皮表面標志物，但特異性表達CD4、CD14、CD32(FcⅡR)、CD44[透明質酸(HA)的受體]等。LSEC正常表型的維持需要旁分泌和自分泌作用以及ECM的支持。而在肝纖維化小鼠模型中[7]，LSEC的表型發生變化，CD31和CD105高表達，而MHC-Ⅱ類分子、CD40、CD86、CD11b以及CD44表達相對低下。LSEC表面CD44表達減少，其清除HA的功能下降，導致ECM增多。黃月紅等[8]在CCl4誘導的肝硬化大鼠模型中發現肝竇CD31表達增強。王憲波等[9]也在二甲基亞硝胺誘導大鼠肝硬化模型中發現，造模成功后大鼠體內HA明顯升高，而LSEC表面CD44和 Ⅷ 因子相關抗原的表達下降。更重要的是，發生肝纖維化時，LSEC免疫功能也從免疫耐受狀態轉變為免疫應答狀態[7]，其通過產生一系列的促炎調節介質如TNFα、MIP-1α、MIP-1β、MIP-2、MCP-1、RANTES等，高效捕獲抗原誘導抗原特異性T淋巴細胞增殖、活化，同時抑制調節性T淋巴細胞的生成。而持續性的炎癥反應進一步促進了肝纖維化的進展。此外，在慢性乙型肝炎肝纖維化中，LSEC表達的ICAM-Ⅰ增強與肝纖維化嚴重程度相關，其可以促進細胞毒性T淋巴細胞經肝竇狀內皮間隙從血流向靶細胞移動，促進炎癥和免疫反應[10]。

1.2 肝竇毛細血管化和血管生成 已分化的LSEC具有特征性的窗孔結構，且窗孔內皮下缺乏完整的基膜。影響窗孔大小和數目的因素很多，如壓力、藥物、毒物、性激素、乙醇、5-羥色胺、尼古丁等[1,11]。來源于肝細胞和HSC的血管內皮生長因子(VEGF)是調節LSEC表型的重要分子,VEGF以2種途徑即NO-依賴途徑和非NO-依賴途徑維持LSEC的窗孔表型[12]。在各種病因如酒精性肝損傷、非酒精性脂肪肝、中毒性肝損傷和胃內酒精輸灌模型進展為肝纖維化之前，都觀察到LSEC獨特的窗孔消失[12]，因此LSEC窗孔變化先于肝纖維化。陸雄等[13]在二甲基亞硝胺誘導的大鼠肝硬化模型中，也發現LSEC窗孔的改變早于肝細胞壞死、內皮下基底膜形成、肝結構改變及肝纖維化形成。在肝硬化肝臟中，經常發現竇內皮細胞失窗孔及內皮下基底膜的出現[14]，類似于毛細血管，因而這兩種結構的變化又稱為肝竇毛細血管化。我國學者在多種肝纖維化動物模型如CCl4誘導大鼠肝纖維化模型[8]、大鼠酒精性肝硬化模型[15]及家兔非酒精性肝硬化模型[16]等，也都發現了竇內皮細胞失窗孔及內皮下基底膜的出現。大量的證據也表明了肝硬化中存在肝內竇狀毛細血管的重建，而LSEC上的CD31、CD34、 Ⅷ 相關抗原等常見的血管內皮細胞標志物的出現，也提示了肝纖維化時LSEC向毛細血管轉化。窗孔消失使得內皮增厚和過量ECM在Disse間隙的內皮下沉積，而ECM的沉積又使LSEC的窗孔數量大大縮小甚至完全消失，使得肝竇壓力和血流阻力增加，進一步阻礙許多底物通過Disse間隙從肝竇轉移入肝細胞[17]，導致肝臟微循環障礙，進一步促進了纖維化的進展，造成惡性循環。

肝竇血流受影響后，造成低氧環境，進一步誘導LSEC和HSC上的低氧誘導因子表達，從而活化轉錄因子如VEGF，直接或間接地促進血管生成[18]。VEGF與內皮前體細胞例如成血管細胞和分化或成熟的LSEC相互作用。另外，也有證據表明促炎因子TNFα、IL-6和NO等直接促進血管生成[18]。刺激后內皮細胞分泌幾種纖溶酶原激活物和基質金屬蛋白酶(MMP)，這些分子降解親本血管的ECM和血管基底膜，使新產生的內皮細胞侵入周圍基質[19]。而缺氧加速了內皮細胞的增生并形成固體內皮管，同時，由于有絲分裂劑的作用，發生了內皮細胞的DNA合成和分裂，內皮細胞和周細胞合成基底膜并形成管腔[19]，周細胞穿透到管腔的節段中心并構成新毛細血管的結構。最后，血管穩定生成，并且LSEC分泌生長因子例如血小板源性生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)，其吸引支持細胞以穩定新血管。新血管可以通過將炎癥細胞運輸到損傷部位，并通過向再生的成熟組織提供營養物和氧氣來維持慢性炎癥[18]。

1.3 損傷的LSEC激活HSC HSC位于Disse間隙，緊鄰肝細胞和LSEC，其約占肝臟非實質細胞的5%～15%。靜止狀態下的HSC通常很小，細胞質含有維生素A脂滴，在致病因素的持續刺激下，通過復雜的機制激活HSC，使其表型發生變化，轉變為大而平坦的肌成纖維細胞[20]。活化的HSC失去儲存脂質顆粒的能力，轉而具有分泌大量ECM和多種促炎、促纖維化細胞因子的功能，以及增加了PDGF受體和平滑肌肌動蛋白α的表達。而且一旦被激活，HSC的激活作用就會通過很多自分泌系統的作用而自行延續下去[21]，如其表達平滑肌肌動蛋白α與肌成纖維細胞的激活直接相關。目前普遍認為HSC的活化和增殖是肝纖維化發生發展的中心環節。

生理狀態下，已分化具有窗孔的LSEC使HSC保持靜默狀態。DeLeve等[22]證明LSEC產生的NO維持了HSC的靜默狀態，而用阻斷劑阻斷LSEC內皮NO合酶(endothelial NO synthase,eNOS)后，HSC發生了活化，但是NO不能逆轉活化的HSC回到靜默狀態。DeLeve[12]進一步通過體內外實驗證明，已分化具有窗孔的LSEC，通過旁分泌因子使活化HSC沉默，從而抑制肝纖維化進程甚至逆轉該過程；而體外實驗中毛細血管化的LSEC與HSC共培養，HSC有明顯的活化現象，因此毛細血管化的LSEC促進了HSC的活化。

病理狀態下，LSEC還可以通過多種途徑直接或間接地激活HSC。首先，肝損傷早期，LSEC可分泌細胞型FN，其對HSC具有激活作用。在肝纖維病變中，LSEC分泌的FN急劇升高，從而改變了局部ECM的性狀，導致ECM沉積，使靜息狀態的HSC轉變成肌成纖維細胞[23]；此外，FN還能抑制HSC的凋亡。其次，在膽管結扎的肝硬化模型中，損傷的LSEC合成的纖連蛋白-EⅢA增加，進而促進了HSC活化，但最近研究[12]表明纖連蛋白-EⅢA在HSC活化中并不是關鍵因素，而只是促進了HSC的運動。更重要的是，肝損傷中LSEC分泌內皮素(endothelin, ET)，主要是ET-1，其與HSC上的內皮素A受體(ETRA)和內皮素B2受體(ETRB2)結合從而活化HSC并促進HSC自分泌ET。ET-1不僅誘導HSC增殖和收縮，還誘導肝竇性血管收縮，而且增加ECM合成[24]，啟動肝纖維化的發生發展。另外一些研究[25-26]表明，LSEC能分泌IL-33、TGFβ、PDGF等活化HSC，促進肝纖維化發展。最后，當肝竇毛細血管化時，因血氧彌散障礙，可致HSC缺氧，缺氧可致HSC迅速活化，同時毛細血管化的LSEC阻礙肝細胞與血液之間的物質交換，導致肝細胞損傷或者凋亡，致使正常的肝細胞膜對 HSC增殖的接觸性抑制作用喪失，而間接激活HSC[27]。

1.4 促炎細胞因子和信號通路 肝纖維化也是由復雜的細胞因子網絡來調控。慢性損傷導致LSEC窗孔消失，基底膜出現和表型轉換，使其轉變為毛細血管化的LSEC，伴隨著可溶性因子產生和釋放并迅速傳播到相鄰細胞，影響其表型[28]。在眾多的細胞因子中，PDGF和TGFβ的作用最為突出。PDGF是所有多肽促生長因子中對HSC最強的促分裂原[5]，一旦與HSC細胞膜上的受體結合，活化相應的信號通路和轉錄因子，可導致下游的靶基因活化和HSC的活化。其中PDGF-D激活HSC發揮促有絲分裂和促纖維化作用，在肝纖維化基質重塑中具有重要作用[29]。TGFβ是已知的最強的促肝纖維化誘導劑[5]，損傷的LSEC分泌TGFβ1增多，TGFβ1的主要作用是刺激HSC活化，并且活化的HSC自分泌TGFβ1作用于自身和LSEC,該循環對肝纖維化進展形成重要的正反饋[30]。Cui等[31]研究表明，TGFβ1還誘導基質產生基因的表達，并且通過下調MMP和促進金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP)來抑制ECM的降解，導致膠原纖維過度沉積、促進肝纖維化的發展。此外，LSEC分泌TGFβ1，與肝細胞膜上的受體結合，介導肝細胞凋亡，并抑制間質細胞分泌肝細胞生長因子以及抑制肝細胞生長因子對肝細胞有絲分裂的促進作用，間接抑制肝細胞的分裂和增殖，從而促進了肝纖維化發展[32]。

另外，慢性損傷導致LSEC中成纖維生長因子受體1持續活化，其干擾肝損傷修復的趨化因子CXC亞家族受體7-Id1途徑并且有利于趨化因子CXC亞家族受體4驅動的促纖維化血管生成反應，從而引起肝纖維化[33]。肝硬化中常常伴有腸源性內毒血癥，因此作為最先暴露于門靜脈脂多糖的LSEC，可通過Toll樣受體(TLR)4/MyD88信號轉導途徑經不同的機制參與肝纖維化發生[34]。靜息狀態下的HSC高表達BAMBI，它是一種內源性TGFβ的抑制劑。而TLR4下調BAMBI使HSC對TGFβ誘導的信號敏感[35]，促進了HSC的活化。TLR4信號還促進HSC產生FN, HSC衍生的FN誘導LSEC的遷移和血管生成，促進肝纖維化[35]。另外，TLR4激活還上調如Kupffer細胞和HSC等細胞分泌促炎細胞因子和趨化因子的表型。活化的HSC進一步產生大量ECM參與肝纖維化的形成。

1.5 ECM的生成和降解失衡 ECM包括膠原和非膠原糖蛋白、蛋白多糖和彈性蛋白等，他們構成間質細胞的基質即上皮細胞和血管的基底膜。活化的HSC合成膠原的能力極強，約為LSEC的20倍，但主要合成Ⅰ型膠原，而LSEC主要合成Ⅳ型膠原。黃月紅等[8]在CCl4誘導大鼠肝硬化模型中發現早期Disse間隙Ⅳ型膠原沉積，隨著CCl4損傷的加重，肝竇內皮下出現連續的基膜伴隨Ⅳ型膠原沉積和LN持續增多，進而推測Ⅳ型膠原和LN沉積共同構成連續的基底膜。Disse間隙Ⅳ膠原沉積，這一病理變化也啟動了參與肝纖維化的各種因子，繼而導致Ⅰ和 Ⅲ 膠原的進一步沉積。另外，損傷早期，LSEC可分泌細胞型FN，其對HSC具有激活作用。在肝纖維病變中，LSEC分泌的FN急劇升高，從而改變了局部ECM的性狀，導致了ECM的沉積，同時使靜息狀態的HSC轉變成肌成纖維細胞，進一步促進了ECM的產生[27]。肝臟內過量膠原形成及沉著以及ECM局部重建和重分布[32]，導致ECM合成和降解失衡，使其在肝臟中過多積聚和沉積，特別是后期的降解減少是肝纖維化形成的主要機制之一。ECM沉積于Disse間隙，導致血液物質交換功能障礙，加重肝損傷，使肝纖維化難以逆轉。

筆者認為，在諸多機制中，LSEC在肝纖維化中發揮導火線的作用。各種損傷因素首先作用于LSEC, 造成LSEC表型和功能變化，LSEC失窗孔加之EMC的積累繼而形成肝竇毛細血管化，毛細血管化的LSEC是肝纖維化發生發展的必要條件。肝竇毛細血管化進一步導致HSC的活化，伴隨著細胞因子的釋放維持HSC的活化狀態，同時也相應地導致更多的ECM沉積，進一步影響肝臟血液物質交換和微循環障礙。

目前多項研究[24,28,33]均已證明，肝竇毛細血管化在肝纖維化發展過程中發揮關鍵作用。國外的學者們對LSEC與HSC相互作用的機制研究更為深入。而我國在LSEC與肝纖維化的研究中，主要集中于各種肝纖維化動物模型，LSEC的形態變化，LSEC窗口變化對纖維化發展的影響以及肝竇狀毛細血管化的LSEC表面分子及分泌的細胞因子的變化，總體來講主要是現象研究，缺乏更為深入的機制研究，這也是需要改進的地方。另外我國作為傳統中藥的發源地，也報道了多種中藥如扶正化瘀方、白芍總甙、芪術顆粒、蟲草菌絲提取物等在肝纖維化動物模型中逆轉肝竇毛細血管化、抑制肝纖維化的效果[39-41]。

2 針對LSEC逆轉肝纖維化治療的新靶點

對肝纖維化機制的深入了解，有助于尋找有效的抗纖維化的治療方法。目前關于抗纖維化的成果頗多，但大部分停留在基礎和動物實驗研究上，尚無確切有效的抗纖維化藥物。因此，在病因治療的基礎上，探討LSEC在肝纖維化中的作用，可以為抗纖維化治療提供新的線索。

2.1 抑制LSEC分泌的細胞因子和信號通路 抑制PDGF和TGFβ等可以調控HSC的活化，抑制ECM生成的細胞因子從而能夠抑制肝纖維化發生。目前已經在評估幾種人源化拮抗TGFβ的抗體，其中fresolimumab用于治療轉移性乳腺癌、非小細胞癌、彌漫性系統性硬化和節段性腎小球硬化的研究，正在處于Ⅰ期或Ⅱ期臨床試驗[42-43]。di Sario等[44]在SD大鼠實驗中表明，吡非尼酮通過抑制蛋白激酶C介導的Na+/H+交換可顯著抑制TGFβ誘導的Ⅰ型膠原產生，并抑制大鼠PDGF誘導的HSC增殖。目前，吡非尼酮用于治療特發性肺纖維化已經在歐洲和日本等地上市，處于Ⅳ期臨床試驗階段。

2.2 恢復LSEC的窗孔 HSC激活后轉變為肌成纖維細胞是肝纖維化發生發展的中心環節。有窗孔的LSEC保持HSC的靜默狀態，通過藥物促進LSEC的窗孔恢復，有助于改善HSC。You等[45]在CCl4誘導的肝纖維化小鼠模型中發現，人重組的血管內皮細胞抑制素能夠緩解肝竇狀毛細血管化，但在其他原因造成的肝纖維化模型中的作用需要進一步研究。VEGF以2種途徑即NO-依賴途徑和非NO-依賴途徑維持LSEC的窗孔表型, 而可溶性鳥苷酸環化酶(soluble guanylyl cyclase，sGC)是NO-依賴途徑中的重要酶分子。Xie等[46]研究表明，sGC的激動劑BAY60-2667可以使毛細血管化的LSEC恢復至具有窗孔的已分化水平, 從而使HSC恢復到靜默狀態，抑制甚至逆轉肝纖維化。目前，一種用于治療充血性心衰的新型sGC激動劑BAY58-2667已經進入Ⅱ期臨床試驗，但是關于sGC的激動劑用于肝纖維化治療的臨床研究未見報道。

2.3 抗血管生成治療 VEGF促血管生成作用最強，大部分抗血管生成療法主要集中于阻斷VEGF信號通路。在大鼠肝纖維化模型中，用貝伐單抗治療通過中和肝細胞產生的VEGF并阻斷其對HSC活化的影響可減輕肝纖維化[47]。近年來抗血管生成的方法包括使用多受體酪氨酸激酶抑制劑索拉非尼,其靶向Raf/細胞外信號調節激酶和PDGFRβ信號級聯以及VEGFR信號轉導途徑，與肝內纖維化發生和膠原沉積的顯著減少有關[47]。但是多受體酪氨酸激酶抑制劑除了作用于LSEC上促血管生成的VEGF和纖維母細胞生長因子受體，還作用于其他多種細胞，并影響細胞增殖、ECM轉運和免疫調節的其他激酶，因而特異性較差[48]。肝細胞和LSEC高表達的CD147，其可以通過VEGF-A/VEGFR2信號調節通路促進肝纖維化進展。通過阻斷CD147，可抑制該信號通路介導的血管生成，有利于抑制肝纖維化[49]。

2.4 增加ECM降解和減少ECM產生 MMP是肝內ECM的主要降解酶，通過上調MMP或下調TIMP活性，有助于促進肝纖維化逆轉。另外，ECM的膠原纖維交聯，主要由賴氨酰氧化酶(lysyl oxidase，LOX)L2介導。LOXL2可能在纖維化逆轉期間阻礙ECM降解，阻斷LOXL2并且在CCl4誘導的肝纖維化小鼠模型中已經觀察到抗纖維化活性[50]。Simtuzumab(GS-6624)是LOXL2的非競爭性變構抗體抑制劑，臨床已用于治療纖維化疾病和癌癥，并且正在進行特發性肺纖維化、晚期纖維化和肝硬化患者以及原發性硬化性膽管炎患者的Ⅱ期研究 。Simtuzumab(GS-4779)也應用于非酒精性脂肪肝和2期或3期肝硬化患者的Ⅱ期研究，其療效有待于進一步驗證和評估。也有報道[28]通過靶向 TIMP-2的siRNA治療CCl4誘導的大鼠肝纖維化，抑制 HSC激活，促進 ECM 降解。

2.5 針對肝臟微環境，改善血管舒張功能 抗氧化劑如維生素A、E和黃酮類，可改善eNOS活性，增加NO的生物利用度并改善抗氧化酶活性，從而使NO增多。他汀類藥物如辛伐他汀通過減少總膽固醇，改善Akt依賴的eNOS甲基化以及減少氧化型低密度脂蛋白等改善內皮細胞功能。非選擇性β受體拮抗劑如卡維地洛和血管緊張素受體拮抗劑等也可作用于相應的受體，緩解氧化應激，舒張血管[51]。

3 小結

筆者認為，肝纖維化病理過程復雜，從LSEC毛細血管化到靜息HSC的活化、ECM 的沉積以及肝纖維化的演進都涉及很多機制。對其中的任何一個過程進行干預都將對肝纖維化的逆轉起著積極的作用。因此，在病因治療的基礎上，依據患者肝纖維化程度結合新型靶點抗纖維化藥物治療具有廣泛的應用前景。sGC的激動劑等在肝纖維化的治療中極具開發價值。聯合其他靶點如抑制TGFβ和PDGF，增加ECM降解的藥物也有不可忽視的作用。而抗血管生成療法和改善微循環的藥物，雖然對肝臟血管選擇性較差，但是對于肝硬化后期門靜脈高壓患者，可根據具體病情選擇性使用。

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(本文編輯：王 瑩)

Role of liver sinusoidal endothelial cells in the development and progression of liver fibrosis and related therapeutic strategy

DUYanqin,WUJun,YANGDongliang.

(DepartmentofInfectiousDiseases,UnionHospitalAffiliatedtoTongjiMedicalCollegeofHuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022,China)

Liver sinusoid endothelial cells are the first defense mechanism that protects the liver against various injuries, and they also play a significant role in the development of liver fibrosis and liver cirrhosis caused by chronic liver injury. They are involved in liver fibrosis by mediating liver inflammation, participating in sinusoid capillarization and revascularization, activating hepatic stellate cells, secreting many proinflammatory cytokines, participating in extracellular matrix formation, and mediating liver microcirculation disturbance. Clarification of these mechanisms helps to identify new targets and develop new regimens for the treatment of liver fibrosis.

liver cirrhosis; liver sinusoidal endothelial cells; therapy

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.03.008

2017-02-08；

2017-02-13。

杜艷芹(1991-)，女，主要從事肝病相關研究。

楊東亮，電子信箱：dlyang@hust.edu.cn。

R575.2

A

1001-5256(2017)03-0438-07