藥用植物中鯊烯環氧酶的生物信息學分析

趙志新，王凡

（商洛學院生物醫藥與食品工程學院，陜西商洛 726000）

三萜皂苷（Triterpenoid saponins）作為一類重要的藥用植物次生代謝產物，具有保護肝臟、抗凝血、消炎抗病毒、降低膽固醇等多方面的藥理作用[1]。三萜類化合物在自然分布很廣，在菌類、蕨類植物、單子葉植物和雙子葉植物、動物和海洋生物中都有存在，尤其是在雙子葉植物中分布最為廣泛，主要分布于菊科、石竹科、五加科、豆科、遠志科、桔梗科及玄參科[2-4]，特別是普遍存在于絞股藍、人參、三七、柴胡以及積雪草等多種藥用植物中[5]。鯊烯環氧酶（Squalene epoxidase,SE）也被稱為角鯊烯單加氧酶，在細胞內質網中催化鯊烯（角鯊烯）為環氧鯊烯[6]。在植物中，SE催化鯊烯氧化生成2,3-氧化鯊烯，因此被認為是三萜皂苷類化合物合成中一個公認的關鍵限速酶[7]。同時研究發現，牛樟芝三萜途徑中最后一步關鍵的限速酶也是鯊烯環氧酶（SE）[8]。人參植物中至少含有2種角鯊烯環氧化物酶，一種參與三萜皂苷的合成，另一種可能參與了植物甾醇的合成[9]。本文主要是利用生物信息學的手段，查找已經公布的藥用植物中的SE基因的序列數據，并經過整理、分析，根據得到的結果來預測他們之間的同源性和進化關系，為下一步通過分子生物學技術進行基因功能分析及代謝通路研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

檢索已發表有關SE研究的學術論文，然后從NCBI查找已公布的相關基因序列。

1.2 方法

運用BLASTn 2.6.0對藥用植物中SE核酸序列的同源性進行分析；借助MEGA6.0構建系統發育進化樹，分析藥用植物中SE基因的進化關系。

2 結果與分析

2.1 不同藥用植物SE核酸序列

截止2017年3月10日為止，從NCBI數據庫中下載已經公布的藥用植物SE的核酸序列，共28條，包括擬南芥，刺五加，枇杷等10種藥用植物的核酸序列（見表1）。

表1 不同植物SE核酸序列來源

2.2 核酸序列的比對分析

將收集到的28條SE序列與擬南芥和丹參基因組做BLAST分析。使用BLASTn 2.6.0分別分析擬南芥和丹參基因組數據中的潛在SE序列，選擇相似性較高的序列。獲得結果如圖1～圖3。結果顯示：擬南芥潛在的SE基因序列與刺五加actinSE基因序列相似性最高。同源性分別是刺五加actin（丹參）82%，枇杷SE2（擬南芥）75%，刺五加actin3（擬南芥）86%，刺五加actin2（擬南芥）83%，刺五加actin1（擬南芥）86%。（括號里的物種名為做BLAST的參照基因組）

圖1 丹參基因組與SE序列BLAST圖 [刺五加actin(丹參）]

圖2 擬南芥基因組與SE序列BLAST圖[刺五加actin(擬南芥）]

圖3 擬南芥基因組與SE序列BLAST圖 [枇杷SE2(擬南芥）]

2.3 構建系統進化樹

為了對藥用植物中三萜皂苷的代謝通路做更深層次的分析，將所獲的NCBI數據庫中已經注冊的SE核酸序列，經同源性分析后做系統進化分析。將BLASTn搜索得到同源性較高的核酸序列，使用MEGA6.0軟件構建系統進化樹，依據五種不同算法所構建的進化樹，如圖4～圖8。

2.3.1 Maximum Likelihood Tree算法

由圖4可知，從進化樹圖上來分析，5種SE序列聚成兩大支，刺五加actin1,3（擬南芥）和枇杷（擬南芥）聚為一大支；刺五加actin（丹參）和刺五加actin2（擬南芥）聚集為一支；刺五加actin2（擬南芥）和刺五加actin1,3（擬南芥）的親緣關系較遠與枇杷（擬南芥）親緣關系較近。

2.3.2 Neighbor-joining Tree算法

圖4 Maximum Likelihood算法

圖5 Neighbor-joining算法

由圖5可知，5條SE核酸序列系統進化分析結果表明，5種SE序列聚成三大支，刺五加actin1,3（擬南芥）聚為一大支；枇杷（擬南芥）獨立聚為一支；刺五加actin（丹參）和刺五加actin2（擬南芥）為一支；枇杷（擬南芥）與刺五加actin（擬南芥）和刺五加actin(丹參)的親緣關系較遠。其中，刺五加actin與丹參和擬南芥SE親緣關系較近，但刺五加actin（擬南芥）之間的親緣關系較遠。

2.3.3 Maximum Parsimony Tree算法

由圖6可知，5條SE核酸序列系統進化分析結果表明，5種SE序列聚成兩大支，刺五加 actin1,2,3（擬南芥）和刺五加 actin（丹參）聚為一大支；枇杷（擬南芥）獨立聚為一支；刺五加actin1,2,3(擬南芥)和刺五加actin（丹參）親緣關系較近，而枇杷（擬南芥）的親緣關系較遠。

圖6 Maximum Parsimony算法

2.3.4 UPGMA Tree算法

由圖7可知，5條SE核酸序列系統進化分析結果表明，5種SE序列聚成三大支，刺五加actin1,3（擬南芥）聚為一大支；枇杷（擬南芥）獨立聚為一支；刺五加actin（丹參）和刺五加actin2（擬南芥）為一支；枇杷（擬南芥）與刺五加actin（擬南芥）和刺五加actin（丹參）的親緣關系較遠。其中，刺五加actin與丹參和擬南芥SE親緣關系較近，但刺五加actin（擬南芥）之間的親緣關系較遠。

2.3.5 Maximum Parsimony Tree算法

由圖8可知，5條SE核酸序列系統進化分析結果表明，5種SE序列聚成兩大支，刺五加actin1,3(擬南芥)和枇杷（擬南芥）聚為一大支；刺五加actin與丹參和擬南芥SE為一支；刺五加actin與丹參和擬南芥SE與刺五加actin1,3(擬南芥)的親緣關系較遠，而與枇杷（擬南芥）親緣關系較近。

圖7 UPGMA算法

圖8 Maximum Parsimony算法

3 討論與結論

將獲得的SE的核酸序列提交到美國國立生物技術信息中心（NCBI）的核酸序數據庫進行BLASTn相似性序列，結果顯示：擬南芥SE基因序列與刺五加actinSE基因序列相似性最高。為了分析SE的進化情況，從NCBI的數據庫中選取與SE基因編碼相似性較高的5條序列（丹參-刺五加actin（HM051058.1），擬南芥-枇杷SE2（NC_003071.7），擬南芥-刺五加 actin3（NC_003074.8），擬南芥-刺五加actin2（NC_003070.9），擬南芥-刺 五 加 actin1（NC_003076.8）），同源性分別達到刺五加actin（丹參）82%，枇杷SE2（擬南芥）75%，刺五加actin3（擬南芥）86%，刺五加actin2（擬南芥）83%，刺五加actin1（擬南芥）86%。從系統進化樹可以看出，刺五加actinSE基因與擬南芥SE基因的親緣關系較近，這與序列BLASTN的分析結果一致。系統進化分析將包括人參在內的24種植物的SE進行比較分析，從結果中可以得出，刺五加actin1,2,3（擬南芥）和刺五加actin（丹參）親緣關系較近，而枇杷（擬南芥）的親緣關系較遠，這符合自然的進化規律。

由于鯊烯環氧酶在植物中存在的種類不多，且大多在藥用植物中，特別是在人參屬植物中，已發現并命名的基因至少有17個基因[10]。有一部分藥用植物中的SE基因已經被克隆出來[5,7,11-17]，而桔梗中的三萜皂苷代謝通路的理論研究還不成熟。因此，在藥用植物中分析SE基因可以為揭示三萜皂苷的代謝通路、利用植物基因工程技術人工合成三萜皂苷具有重要意義，也為下一步克隆這些基因提供生物信息學理論依據。

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