安徽烏菜游離小孢子培養及植株再生體系建立

秦艷梅，王明霞，江海坤，嚴從生，王艷，田紅梅，張其安，方凌

（安徽省農業科學院園藝研究所，合肥，230031）

●育種研究●

安徽烏菜游離小孢子培養及植株再生體系建立

秦艷梅，王明霞，江海坤，嚴從生，王艷，田紅梅，張其安，方凌

（安徽省農業科學院園藝研究所，合肥，230031）

以6份安徽烏菜為試材，研究基因型、6-BA、AG對烏菜小孢子胚狀體發生的影響及6-BA對植株再生的影響。試驗結果表明，不同基因型烏菜的小孢子胚誘導率具有明顯差異，6份烏菜材料中有3份誘導出胚狀體，H-4出胚率最高，平均每花蕾誘導8.76個胚；NLN-13培養基中添加0.2 mg/L 6-BA和AG 10 mg/L均能促進胚狀體發生，后者促進作用更明顯；MS培養基中添加1 mg/L 6-BA可提高烏菜胚狀體成苗率。

烏菜；小孢子培養；誘導率；胚狀體；植株再生

安徽烏菜是安徽省名優特產，是十字花科蕓薹屬白菜亞種的一個變種，雜種優勢明顯，常規雜交法育種年限較長，結合現代生物技術進行烏菜育種對提高育種水平和效率至關重要。

游離小孢子培養是育種中最有效的生物技術之一，在大白菜、不結球白菜、菜薹等十字花科蔬菜作物上多有報道[1～4]，而對于烏菜的小孢子培養研究較少，存在胚狀體誘導率低的問題。本試驗選用6份不同基因型的安徽烏菜為試材，進行游離小孢子培養，探討6-BA（6-芐氨基嘌呤）和AG（阿拉伯半乳聚糖）對烏菜游離小孢子培養胚狀體誘導率的影響及6-BA對胚狀體植株再生的影響，為建立優化烏菜游離小孢子培養技術體系提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用安徽地方烏菜材料6份，材料編號1403、1404、1408、1416、1418、H-4。

試驗材料于2015年9月6日播種，10月4日定植，露地栽培，常規管理。2015年12月，每份材料選取10株移植到塑料大棚。2016年3～4月初花期至盛花期選取適宜大小的花蕾進行游離小孢子培養。

1.2 試驗方法

①胚誘導培養 小孢子培養基本操作流程參照申書興等[5]大白菜游離小孢子培養方法。在初花期至盛花期，于晴天8：00～10：00，選取健壯、大小適宜的花蕾（花瓣與花藥長度比例1∶2～3∶4，多數小孢子處于單核靠邊期），以主枝和一級側枝上的花蕾為宜。放入25 mL無菌小燒杯中，首先用70%酒精消毒30 s，其次用2.5%NaClO溶液消毒5 min，然后用無菌水沖洗3次；加入B5無菌液體培養基，用玻璃棒輕輕擠壓使小孢子游離出來，經350目濾網過濾，收集濾液于15 mL旋蓋離心管中，于1 000 r/min離心3 min，棄上清，重復2次，得游離純化的小孢子。

將分離純化后的小孢子分別附加 0、0.2、0.4 mg/L 6-芐氨基嘌呤（6-BA）或0、5、10、20 mg/L阿拉伯半乳聚糖（AG）的NLN-13培養基制成懸浮液，添加活性炭0.1 mg/mL，調整小孢子密度約1× 105個/L，分裝于直徑60 mm的無菌培養皿中，以Parafilm膜封口，每份材料取花蕾25個，分裝于4皿培養，重復 3次。33℃黑暗熱激培養24 h后，轉入25℃黑暗條件下培養，有肉眼可見的胚出現時，轉移到轉速60 r/min的搖床上繼續暗培養至形成子葉型胚狀體，3周后統計胚狀體數目。

②胚狀體植株再生 利用附加濃度為0、1 mg/L 6-BA，10 g/L瓊脂，30 g/L蔗糖的MS固體無菌培養基作為胚狀體成苗培養基，將獲得的烏菜成熟胚狀體轉接入成苗培養基中，3周后統計成苗率。

2 結果與分析

2.1 供體基因型的影響

在6份烏菜材料游離小孢子培養中，有3份誘導出胚狀體（H-4、1404、1408），占參試材料的50%。其中H-4產胚能力較強，在添加10 mg/L AG的NLN-13培養基中，平均每花蕾可誘導8.76個胚；1408次之，平均每花蕾可誘導2.91個胚；1404平均每花蕾可誘導1.16個胚。而1403、1416、1418則沒有胚狀體產生。可見，不同基因型烏菜材料的小孢子培養胚狀體誘導率存在差異。

2.2 6-BA對烏菜小孢子胚狀體誘導的影響

在NLN-13誘導培養基中加入不同濃度的6-BA，胚狀體誘導率統計結果見圖1。對于能誘導出胚的3份材料，6-BA濃度對胚狀體誘導率的影響均呈單峰變化，低濃度的6-BA對烏菜小孢子胚誘導有一定的促進作用。當6-BA濃度為0.2 mg/L時，胚誘導率達到最高，烏菜1404、1408、H-4平均每花蕾誘導胚狀體數目依次為3.64、1.16、0.68個。

2.3 AG對胚狀體誘導的影響

在NLN-13誘導培養基中加入不同濃度AG，25℃暗培養20 d，統計結果表明（圖2），低濃度的AG對烏菜小孢子胚誘導有一定的促進作用，高濃度的AG則有抑制作用。當AG濃度為10 mg/L時，胚誘導率達到最高，3份供試烏菜的胚狀體誘導率隨濃度變化趨勢表現一致。

2.4 6-BA對胚狀體成苗的影響

選擇成熟的烏菜胚狀體轉接入成苗培養基（圖3），表1中結果表明，在MS培養基中加入1 mg/L 6-BA可提高烏菜試材1408和H-4的胚狀體成苗率，且促進作用顯著，但1404的胚狀體并未形成雙單倍體植株，說明在培養基中添加6-BA并不是對所有基因型的烏菜胚狀體成苗具有促進作用。

3 結論與討論

小孢子胚胎發生能力受基因調控。在白菜小孢子培養研究中發現，不同基因型間小孢子胚狀體誘導率差異很大[1，6，7]。本試驗中6份供試烏菜有 3份可誘導出胚狀體，成功率為50%，不同基因型烏菜出胚率差異較大，與前人在其他作物上相關研究結果一致。

圖1 NLN-13培養基中添加6-BA對烏菜小孢子胚狀體誘導率的影響

圖2 NLN-13培養基中添加AG對烏菜小孢子胚狀體誘導率的影響

圖3 烏菜小孢子培養胚狀體及植株再生

適量的6-BA可顯著提高白菜小孢子胚狀體或愈傷組織誘導率[2～4]；蔣武生等[8]則認為加入 6-BA和NAA抑制大白菜小孢子胚發生。AG對小麥、大白菜和普通白菜小孢子培養胚發生和直接成苗有促進作用[9，10]。本試驗結果表明，在NLN-13培養基中分別添加6-BA和AG可大大提高烏菜小孢子胚狀體誘導率，促進小孢子細胞發育由配子體途徑向孢子體途徑轉變。在一定程度上解決烏菜胚狀體誘導率低的問題，但是本試驗中6份供試材料僅3份誘導出胚，并不能解決所有烏菜難誘導出胚的問題，所以針對其他烏菜材料胚誘導條件以及胚胎發生機理還需要進一步試驗摸索，以優化烏菜小孢子培養技術體系。

表1 6-BA對烏菜小孢子胚狀體成苗的影響

本試驗烏菜小孢子培養過程中，在MS培養基中附加1 mg/L 6-BA有促進烏菜1408和H-4的胚狀體再生植株的作用，而1404胚狀體則未形成植株，可能由試材1404的胚狀體本身生活力弱和其對6-BA的應答反應不同2種原因共同導致。通過改變6-BA的濃度或加入一定濃度AG是否能進一步提高胚狀體成苗率尚待研究。

[1]陳曉峰，張明培，徐榕雪，等.影響大白菜游離小孢子培養胚胎發生因素的研究[J].吉林農業科學，2014，39（5）：76-79.

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[3]姜鳳英，馮輝，王超楠.小白菜小孢子培養胚狀體的誘導[J].沈陽農業大學學報，2006，37（5）：763-765.

[4]吳藝飛，丁茁荑，肖杰，等.菜薹小孢子培養誘導胚狀體的影響因素研究[J].湖南農業科學，2013（19）：16-19.

[5]申書興，趙前程，劉世雄，等.四倍體大白菜小孢子植株的獲得與倍性鑒定[J].園藝學報，1999，26（4）：232-237.

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[7]成妍，班青宇，王倩，等.不結球白菜游離小孢子培養及再生植株的倍性鑒定 [J].南京農業大學學報，2009，32（2）：25-29.

[8]蔣武生，原玉香，張曉偉，等.提高大白菜游離小孢子胚誘導率的研究[J].華北農學報，2005，20（6）：34-37.

[9]Letarte J,Simion E,Miner M,et al．Arabinogalactans and arabinogalactan-protein induce embryogenesis in wheat (Triticum aestivumL．)microspore culture [J].Plant Cell Rep,2006,24:691-698.

[10]王愛杰，章云，劉洋，等.AG和AGPs對大白菜和普通白菜（小白菜）小孢子胚狀體誘導及成苗的影響[J].中國蔬菜，2012（4）：62-66.

Dissociative Microspore Culture of AnhuiPorphyra haitanensisand Establishment of Plant Regeneration System

QIN Yanmei,WANG Mingxia,JIANG Haikun,YAN Congsheng, WANG Yan,TIAN Hongmei,ZHANG Qi'an,FANG Ling
(Horticultural Institute,Anhui Academy of Agricultural Sciences,Hefei 230031)

The microspore embryogenic impact factors including genotypes,6-BA and AG the effect of 6-BA on plant regeneration were studied using the six AnhuiPorphyra haitanensiscultivars as the materials.The results showed that the frequency of microspore-induced embryos varied remarkably among the different genptyes cultivars,and embryos were included from three cultivars.H-4 had the highest induction rate with the frequency of 8.76 embryos per bud.Adding 0.2 mg/L 6-BA or 10 mg/L AG to NLN-13 medium could promote the embryos induction,and the latter was more obvious.1 mg/L 6-BA added to MS medium could improve the plant regeneration rate of AnhuiP.haitanensisembryos.

Porphyra haitanensis;Microspore culture;Inductivity;Embryoid;Plant regeneration

S634.4

A

1001-3547（2017）06-0029-04

10.3865/j.issn.1001-3547.2017.06.012

安徽省農業科學院院長青年創新基金項目（15B0338）；國家現代農業產業技術體系建設專項資金項目（GARS-25-G-18）

秦艷梅（1987-），女，研究實習員，從事蔬菜育種工作，電話：15855132330

方凌，通訊作者，研究員，從事蔬菜品種選育及產業化研究

2016-12-13