可降解PBSLA嵌段共聚物對蚯蚓酶活的影響

吳昊

摘 要：采用自然土壤法，研究了可生物降解PBSLA嵌段共聚物對蚯蚓超氧化歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）兩種抗氧化酶活性的影響。結果表明：整個實驗過程中，SOD和POD均在一定的時期內受到了刺激作用，但這種刺激都比較小。低分子量共聚物的影響出現較早，高分子量共聚物的對蚯蚓的毒性影響經過一定時間才表現出來，即滯后現象。值得注意的是，實驗末期，實驗組中蚯蚓酶活的變化與空白組基本處于相同水平。總之，實驗過程中蚯蚓未出現明顯的死亡現象，該聚合物對蚯蚓是安全的。

關鍵詞：聚丁二酸丁二醇酯-聚乳酸；蚯蚓；超氧化歧化酶過氧化物酶；過氧化物酶

研究發現由于聚酯中大量酯鍵的存在，所以很多聚酯能夠被微生物識別而發生微生物降解。其中聚丁二酸丁二醇酯（PBS）是一種具有廣泛應用前景的可生物降解聚酯。所以研究該聚合物對生態系統的毒性是非常有價值的。

研究物質對土壤環境毒性的一種常用的方法是利用蚯蚓進行試驗。經過研究學者的努力，通過判斷蚯蚓體內酶活的變化來判斷環境的污染程度已成為也一種標準。蚯蚓體內的抗氧化物酶包括超氧化物岐化酶（SOD），過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）。其中SOD的作用是能夠將機體內的O2-轉變為H2O2，而CAT和POD可以將H2O2分解為氧氣和水。

關于其它可降解材料對蚯蚓的影響已有研究，然而關于PBSLA嵌段共聚物對蚯蚓體內抗氧化物酶活的影響還沒有報道。因此，文章研究了PBSLA嵌段共聚物對蚯蚓體內兩種抗氧化物酶活的影響。

1 試驗材料與測試方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗樣品

所提供的試驗樣品為實驗室所合成PBSLA嵌段共聚物，分子量分別為5000、20000和30000。

1.1.2 試驗試劑和測試儀器

考馬斯亮藍G-250；牛血清蛋白；DNS；葡萄糖。

組織粉碎機；人工培養箱。冷凍離心機。UV-2006A型可見紫外分光光度計。凝膠液相色譜儀。

1.1.3 供試蚯蚓和土壤

蚯蚓購于天龍蚯蚓養殖公司，實驗前預處理：選擇大小均勻（0.3-0.5g），生殖環比較明顯的健康成蚓。

自然突然實驗法：取自咸陽郊區表土（0～20cm厚的地表土），烘干，研磨，過篩（10目，2mm），試驗土壤為 土，全氮0.92g·kg-1，全磷0.82g·kg-1，土壤有機質10.76g·kg-1（有機碳6.48g·kg-1），速效鉀289.0mg·kg-1，pH=8.4，堿解氮58.87mg·kg-1，速效磷14.5mg·kg-1。

1.2 試驗步驟

根據OECD guideline No 207標準方法，進行毒性試驗研究。

1.2.1 蚯蚓預培養

將直徑為15cm的三層濾紙鋪在1l的燒杯中，滴加5ml去離子水，充分潤濕濾紙，并使得濾紙和燒杯底部無空隙存在。將試驗所需蚯蚓放在濕潤的濾紙上。（注：蚯蚓數量不宜太多，可分為多個燒杯培養。）然后用濾紙將燒杯口封住，并用竹簽對濾紙進行扎孔，最后將燒杯放入人工培養箱中，放置一晝夜。培養箱預設條件：20.5℃， 80%～85%的濕度。

毒性試驗：分別將試驗樣品（三種分子量的PBSLA共聚物）用粉碎機進行粉碎10分鐘，稱取定量的粉末樣品（0.1%wt，0.5%wt，2.5%wt）與0.3g的試驗土壤加到試驗容器中進行混合，攪拌均勻后，用噴霧器定量噴灑6ml自來水，控制容器內的濕度在35%左右。取大小均勻的10條蚯蚓于試驗容器中進行培養，用定性濾紙封口后，在用竹簽進行均勻扎孔。最后試驗容器在人工培養箱中進行培養。培養條件：20.5℃，80%～85%的濕度，每隔12個小時進行光照培養。每隔一定時間進行取樣，然后進行粉碎，提取，測試蚯蚓體內酶活。試驗周期為30天，且每組試驗均設置3組平行樣進行對照試驗。

1.2.2 酶的提取

酶的提取方法：將取出來的每組蚯蚓用自來水進行沖洗后，用濾紙擦干，放入組織粉碎機中，按照一定比例（1mg/ml）加入Tris-HCl緩沖溶液，對蚯蚓進行粉碎，轉速為10000rpm的轉速，將得到的勻漿液用冷凍離心機進行分離（冷凍離心條件：4℃，15000rpm，15分鐘）。取上清液0.5ml，加入0.05mol/l Tris-HCl緩沖液（pH為7.8）1ml，定容至1.5ml。

1.2.3 酶活的測定

酶活性測定：SOD活性的測定參考自俊青等（1998）的方法。POD活性的測定參考呂淑霞等（2003）的方法。

1.2.4 數據統計

利用軟件SPSS17.0將所得到的每組蚯蚓酶活數據，進行統計分析。

2 結果與討論

2.1 PBSLA對SOD酶活的影響

從圖1可以看出，分子量為5.0×103的PBSLA處理組中，在第7d和第14d時（P<0.05），不同含量的處理組中均出現SOD增加的現象。這是由于剛開始由于蚯蚓周圍環境的變化，使得蚯蚓體內的一些平衡被打亂，O2-增多，因此為了更好的適應環境，蚯蚓通過自身的調節，使得體內SOD酶分泌增加，活性也增加。到第28d和42d時（P<0.01），蚯蚓已能夠逐漸的適應外界的環境，因此又恢復到與空白一樣的水平。圖2中可以觀察到，Mn為2.0×104的PBSLA實驗中（P<0.05），第7d和第14d的變化規律與圖一中相似，只是變化趨勢有所減小。這是由于，分子量增加，聚合物中的小分子物質有所減少，因此導致了能夠直接對蚯蚓產生影響的小分子物質減少。從圖3中可以明顯的看出，聚合物分子量達到3.0×104時，不同的處理組中，SOD并沒有發生較明顯的變化。這是由于蚯蚓已經適應了周圍的環境，并且聚合物在降解過程產生的小分子不足以對蚯蚓的SOD產生較大的影響。

2.2 PBSLA對POD酶活的影響

從圖4中可以看出，實驗組中POD的活性均表現出一定的規律性：POD酶活隨聚合物含量的增加而增加，當聚合物的含量為0.5%wt時，酶活變化的速率最大，經過一段時間后酶活又開始緩慢增加（P<0.05）。這是由于剛開始蚯蚓周圍環境的變化，使得蚯蚓機體內POD所分解的物質增加，因此，為了更好的適應環境，POD活性也開始增加。從圖5中可以觀察到第7d和第14d時，實驗組中的POD活性沒有發生明顯的變化，而從第32d開始（P<0.01），POD活性逐漸的增加，與圖1中相比，出現了明顯的滯后現象。這說明了聚合物在降解時是一個比較緩慢的過程，由于剛開始聚合物中的小分子比較少，且沒有發生降解，因此不足以對蚯蚓產生影響，而隨著時間的增長，聚合物逐漸的發生降解，因此這種作用到后期才表現出來。圖6更加說明了聚合物含量為2.5%時，從第32d開始，POD才出現明顯的增加趨勢（P<0.05）。

3 結束語

（1）蚯蚓體內不同種酶對聚合物所做出的反應不同，敏感程度表現為SOD>POD。（2）低分子量聚合物對蚯蚓的影響較高分子量的要大些，但是都是短暫的，最終的結果均表現為與空白組相同的水平。（3）在整個實驗過程中，蚯蚓并沒有出現明顯的死亡、環節脫落、尾溶等現象，所以初步判定PBSLA共聚物對蚯蚓是安全的。