微藻去除水中低濃度硝態氮的研究

楊淼+施宇震+施永生+王琳+胡檸檬

摘要：利用微藻去除水中低濃度硝態氮，無需供應氧氣、不產生二氧化碳且微藻的生物體尚可有利用價值。研究篩選了3種微藻（[FACHB-12]斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）、[FACHB-8]普通小球藻（Chlorella vulgaris）、鹽藻（Dunaliella sp.））進行水中低濃度硝態氮去除率實驗，證明了3種微藻均對水中硝態氮有較好的適應性和去除效果。其中，對NO2-的去除率均大于對NO3-的去除率。淡水藻比鹽藻對水中硝態氮的去除率要高。

Abstract： To remove the low concentration nitrate in water by microalgae， there is no need of oxygen supply， no carbon dioxide produced， and the microalgae organisms still can be useful. Three microalgae， including Scenedesmus obliquus， Chlorella vulgaris and Dunaliella sp. are screened for the experiment of removing low concentration nitrate in water. It was proved that the three microalgae had great adaptability and removal effect on nitrate nitrogen in water. The removal rate of NO2- was higher than that of NO3-. The removal rate of NO3+ of fresh algae is higher than that of Dunaliella salina

關鍵詞：微藻；硝態氮；藻類篩選；去除效果

Key words： microalgae；nitrate nitrogen；algae screening；removal effect

中圖分類號：X703 文獻標識碼：A 文章編號：1006-4311（2017）15-0196-05

0 引言

水污染防治中硝態氮是非常重要的控制物[1]。硝態氮在水中主要以NO2-及NO3-形式存在[2、3]。微生物脫氮是目前經濟、有效及應用最廣泛去除水中氨氮及硝態氮的方法[4、5、6]。但是，微生物脫氮需要動力向水中提供充足的氧氣[7、8]，微生物脫氮過程中產生大量的二氧化碳，處理后生物殘體的處置也是難題[9、10]，處理后的再生水用來灌溉土地，會使硝態氮在土壤里殘留、積累并對地下水造成一定的污染[11]。若進一步篩選微生物，利用微藻去除水中硝態氮，則微藻的易得、生長速率快、占用空間少、光合效率高等獨有特點使硝態氮得到去除的同時，可產生大量氧氣并實現生物固碳、固氮，避免傳統生物處理中供氧消耗動力、產生大量二氧化碳的問題。精純的微藻生物質還有較好的商業價值，會使水中硝態氮去除處理過程低碳、環保及資源化。由此可見，此項研究是十分有意義的。

據報道，杜氏鹽藻Dunaliella tertiolecta可以直接利用水中的NO2-及NO3-為氮源[12]。李濤等[13]通過對20株淡水和海洋微藻的研究，發現柵藻Scenedesmus sp.是最具產業化潛力的微藻，其總脂收獲量和單位體積總脂產率分別為3.5g/L和218.7mg/L.d，并且對亞硝酸鹽的吸收有明顯的效果。李天培等[14]對15種小球藻菌株進行水中高濃度亞硝酸鹽（HN，176.5mmol/L）耐受程度的實驗，經過篩選發現小球藻Chlorella sp.菌株能維持穩定的增長率且細胞內TAG積累量比其他實驗菌株多2倍。小球藻Chlorella sp.對亞硝酸鹽的去除率為60%[15]。

本文主要對12種富油脂微藻（淡水藻9種，鹽水藻3種）進行篩選、馴化，對2種野生雜藻進行對比培養，并分析研究了微海藻對水中NO2-及NO3-的適應性及去除效果。

1 方法及內容

1.1 藻類的篩選及培養

藻類的篩選主要目的是通過篩選過程，產生一個生產富含營養素成分高的目標生物產品的菌株，或者能去除非目標產物及營養物的菌株。查閱文獻資料得知各種藻類的生長環境、自身生物素含量及對水中NO2-及NO3-的去除率等因素的基礎上，確定實驗研究藻種，表1是初步篩選出的15種富油脂藻類的營養成分組成。通過對比15種微藻生長周期、生長速度、生長環境及藻類的營養成分組成，最為有利的研究對象為小球藻、柵藻、微綠球藻、衣藻和鹽藻、螺旋藻等12種微藻為研究對象。

微藻來源：[FACHB-2]小球藻（Chlorella protothecoides）、[FACHB-5]蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）、[FACHB-8]普通小球藻（Chlorella vulgaris）、[FACHB-12]斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）、[FACHB-265]萊茵衣藻（Chlamydomasreinhardtii）來源于中國科學院水生生物研究所（Institute of Hydrobiology，Chinese Academy of Sciences）；螺旋藻（Spirula）、螺旋藻淡水（Spirula）、小球藻淡水（Chlorella sp.）、微綠球藻（Nannochloropsisoculta）、微綠球藻淡水（Nannochloropsisoculata）、鹽藻（Dunaliella sp.）、小球藻F5（Chlorella sp.）來源于中國科學院海洋生物研究所（Institute of Oceanology， Chinese Academy of Sciences）；野生雜藻來源于昆明滇池（第一種來源于滇池草海、第二種來源于滇池排污入口）。

培養基：BG11培養基、SE培養基、f/2培養基。

微藻培養：[FACHB-265]萊茵衣藻（Chlamydomas reinhardtii）使用SE培養基培養，螺旋藻（Spirula）、微綠球藻（Nannochloropsisoculata）、鹽藻（Dunalilla sp.）使用f/2培養基培養，其余全部使用BG11培養。每種藻培養時以1：20（藻液5ml：培養基100ml）接種到玻璃三角瓶中，每日定時搖動三角瓶2次，培養溫度25℃，光照條件2000Lux，培養基pH值6.8-8.0。培養7天，使微藻的吸光度在0.5Abs以上。

1.2 硝態氮的濃度及投加

根據再生水、地表水及地下水等多類水體的硝態氮濃度調查，水體中總氮含量為18.6mg/L，其中80.6%的存在形式是硝態氮[16]。研究設計，投加硝態氮的總含量為15 mg/L，其中亞硝態氮含量占90%，硝態氮含量占10%。濃度梯度分配見表2。

微藻的培養和篩選研究，將培養基和微藻溶液以20：1的比例，即培養基100mL，微藻溶液5mL接種在250mL錐形瓶中，培養7天，使微藻的吸光度在0.5Abs以上，連續加21天污染物。在100mL微藻培養液中投加0.0148mol/L硝酸鈉和0.25mol/L亞硝酸鈉溶液，兩種溶液的每日投加量見表3。

微藻在培養篩選的過程中，每天在加污染物前用紫外分光光度計（波長600納米）測定每種微藻的吸光度，換算成微藻的顆粒密度，計算其生長速率，確定對硝態氮抗性強、生長率高的微藻。

1.3 研究過程

由上選出三種微藻[FACHB-12]斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）、[FACHB-8]普通小球藻（Chlorella vulgaris）、鹽藻（Dunaliella sp.）作研究。

將培養基中用作氮源的NaNO3分5個濃度梯度，具體濃度見表4、表5。

用離子色譜法測定NO2-、NO3-去除率：取第一批篩選試驗中培養21天第4濃度梯度的微藻[FACHB-12]斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）、[FACHB-8]普通小球藻（Chlorella vulgaris）、鹽藻（Dunaliella sp.），分別接種在表4、表5的5種濃度梯度相應的培養基中培養7天，然后每天加入表3中NaNO3和NaNO2第4濃度梯度相應的量，持續加入21天，每天用離子色譜儀測定溶液中NO3-、NO2-的量，計算其去除率。

2 研究結果及分析

2.1 藻類篩選數據分析

對于微藻生長過程中的每日檢測發現，溶液中溶解氧高達20.7mg/L，長勢良好的微藻的pH值范圍為8.5-10.92。微藻的生物質濃度（每升干重）計算方法參考[17]建立的光密度與細胞干重間的關系如下：

根據7天對微藻的復活培養，螺旋藻、淡水螺旋藻及小球藻（鹽水）都沒能成功復活，所以最后培養12種微藻，根據12種海藻21天加入表3中硝酸鈉和亞硝酸鈉的量比較12種藻的生長曲線，見6種有代表性微藻生長曲線圖1～4。

根據12種微藻21天培養生長趨勢曲線對比，發現[FACHB-2]小球藻（Chlorella protothecoides）、[FACHB-5]蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）、[FACHB-8]普通小球藻（Chlorella vulgaris）、[FACHB-12]斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）、小球藻淡水（Chlorella sp.）、鹽藻（Dunaliella sp.）這6種微藻在每種濃度梯度加入量情況下生長趨勢良好；[FACHB-265]萊茵衣藻（Chlamydomasreinhardtii）、微綠球藻（Nannochloropsisoculata）、微綠球藻淡水（Nannochloropsisoculata）在第1、2、3濃度梯度加入量情況下生長呈上升趨勢，第4濃度梯度及第5濃度梯度生長到一星期左右呈現下降趨勢，并且[FACHB-265]萊茵衣藻（Chlamydomasreinhardtii）生長過程中附壁現象比較嚴重，除此之外，其生物細胞會結成大量的團塊狀物質，嚴重影響實驗數據最終的準確度；小球藻F5（Chlorella sp.）在第1、2、3、4濃度梯度情況下生長呈上升趨勢，在第5濃度梯度投加量情況下生長一星期后生長趨勢呈下降狀態；滇池排污溝取樣的雜藻的生長在5種濃度梯度下都呈上升趨勢，滇池草海中的野生雜藻沒有固定的生長趨勢規律。由此可見我們對比第5濃度梯度下各種微藻的生長趨勢曲線就可以篩選出在水中硝態氮濃度為15mg/L下能正常存活的微藻，見圖5。

如圖5所示，能在第5濃度梯度硝酸鈉和亞硝酸鈉投加量的情況下依然呈平穩上升趨勢的微藻有[FACHB-2]小球藻（Chlorella protothecoides）、[FACHB-5]蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）、[FACHB-8]普通小球藻（Chlorella vulgaris）、[FACHB-12]斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）、小球藻（Chlorella sp.）、鹽藻（Dunaliella sp.）。通過分析以上6種生長趨勢良好微藻的平均生長速率圖6，確定此研究篩選的最適微藻。

由圖6可知，在加入第5濃度梯度氮氧化物量的21天連續培養過程中[FACHB-2]小球藻（Chlorella protothecoides）、[FACHB-5]蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）、小球藻（Chlorella sp.）、[FACHB-8]普通小球藻（Chlorella vulgaris）、[FACHB-12]斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）、鹽藻（Dunaliella sp.）的平均生長速率是由大到小的關系。其中前4種都是相同的種類的小球藻系列微藻，由此可見，小球藻種在去除水中硝態氮的方向具有無限潛力。

2.2 硝態氮去除數據分析

通過篩選試驗，發現有6種微藻在添加硝態氮達20mg/L的濃度后仍然能生長良好，證明這6種微藻在加入高濃度硝態氮時能較好存活。

在微藻對硝態氮去除實驗中，每天加入NO3-、NO2-，通過離子色譜法測定每天溶液中NO3-、NO2-的濃度，計算微藻對硝態氮的吸收率。

選擇的[FACHB-8]普通小球藻（Chlorella vulgaris）、[FACHB-12]斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）、鹽藻（Dunaliella sp.）3種微藻，連續21天使用離子色譜儀測定NO3-、NO2-含量，計算每天微藻吸收NO3-、NO2-的量。三種微藻21天平均生長率圖7～9發現，普通小球藻、柵藻兩種淡水微藻培養基中無氮源的情況下，加入的硝態氮污染物的微藻比沒有加入硝態氮微藻生長速率快。但是，對于鹽藻來說加入硝態氮的微藻平均生長率低于不加硝態氮的微藻。

3種微藻對硝態氮的平均每日去除率，見表6。每種微藻對于NO2-的去除率大于NO3-的去除率。普通小球藻在第4濃度梯度（即NaNO3含量1.2g/L）培養基中對NO2-的去除率最高，為72.86%，在沒有氮源的培養基中（即NaNO3含量0g/L）對NO3-去除率最高為28.93%。柵藻在第3濃度梯度培養基（即NaNO3含量0.75g/L）中對于NO2-的去除率最高，為85.66%，在第5濃度梯度（即NaNO3含量1.5g/L）培養基中對于NO3-去除率最高，為62.66%。對于鹽藻，其吸收效果遠沒有兩種淡水藻吸收效果好，在沒有氮源的培養基中（即NaNO3含量0g/L）對NO2-的去除率最高，為17.46%，在第4濃度梯度（即NaNO3含量1.5g/L）對NO3-的吸收率最高為1.64%。

3 結論

①微藻生物能夠在硝態氮濃度較高的水中存活（高達20mg/L），并且將水中的氨氮作為微藻生存所需要的氮源。

②微藻生物對水中的NO2-的去除率高達為85.666%，對NO3-去除率高達62.66%；微藻對硝態氮的吸收中，NO2-的去除率大于NO3-去除率。淡水藻對硝態氮吸收效果遠比鹽藻好。

③微藻脫氮同時產生氧氣并吸收二氧化碳，避免傳統生物處理中供養耗動力、產生大量的二氧化碳，精純的微藻生物質還有較好的商業價值。小球藻、柵藻、鹽藻因其代謝形成的營養物質豐富且具有降血脂、血壓、增阿強免疫力、抗氧化、抗腫瘤、解毒等功效，是很好的保健品。

④微藻對硝態氮去除處理過程低碳、環保及易資源化，將此方法推廣到去除水中其他污染物也會有很大的前景。

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