Apatinib聯(lián)合5-Fu協(xié)同抑制乳腺癌MCF-7細胞的體外研究

安改麗 李 旭 馮 璐 黃尚科 白 俊 趙新漢

Apatinib聯(lián)合5-Fu協(xié)同抑制乳腺癌MCF-7細胞的體外研究

安改麗 李 旭 馮 璐 黃尚科 白 俊 趙新漢

目的 探討阿帕替尼(Apatinib)聯(lián)合5-氟尿嘧啶(5-Fu)對乳腺癌 MCF-7 細胞的抑制作用。方法 采用人乳腺癌細胞株MCF-7，首先采用MTT法及應用流式細胞儀測定不同濃度apatinib作用后對其細胞增殖和周期的影響，其次將MCF-7細胞分為4組，即對照組、Apatinib單藥組、5-Fu單藥組、Apanitib+5-Fu聯(lián)合組。對各組細胞給予相應藥物處理，48 h后分別應用流式細胞儀檢測各組藥物對 MCF-7 細胞株凋亡的作用。結果 Apatinib單藥對MCF-7細胞有增殖抑制作用，且存在時間劑量依賴關系，而對其細胞周期影響不大。與對照組相比，Apatinib聯(lián)合5-Fu作用后有協(xié)同誘導凋亡作用，經(jīng)流式細胞儀檢測，Apatinib組誘導的細胞凋亡率為12.05%，5-Fu組為25.76%。與單藥組比，Apatinib+5-Fu聯(lián)合組凋亡率升高更為明顯，達34.90%(P< 0.05)。結論 Apatinib和5-Fu的聯(lián)合應用在體外協(xié)同抑制乳腺癌MCF-7細胞并誘導凋亡，使抗腫瘤活性顯著增強。

阿帕替尼;；5-氟尿嘧啶；MCF-7；細胞增殖；細胞凋亡

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:702～705)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅女性的生活質量和身心健康。在我國，乳腺癌的發(fā)病率逐年上升，尤其是在農(nóng)村地區(qū)，乳腺癌的致死率極高[1]。乳腺癌分子靶向治療是指針對乳腺癌發(fā)生、發(fā)展有關的癌基因表達產(chǎn)物和信號通路進行治療。腫瘤新生血管生成在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起到了重要作用，因此抗腫瘤血管生成已成為腫瘤治療的1個重要的靶點，也是近年來抗腫瘤治療領域研究的熱點。甲磺酸阿帕替尼片是口服小分子酪氨酸激酶抑制劑，靶向血管內(nèi)皮生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2)，發(fā)揮抗腫瘤血管生成作用。臨床前研究及臨床試驗均證實其對多種小鼠腫瘤模型的腫瘤生長以及對多種實體瘤均有抑制作用[2]。從腫瘤的發(fā)生、血管新生等多方面入手來抑制腫瘤，可以提高抗腫瘤效果。靶向治療與化療聯(lián)合的生物化療模式成為乳腺癌治療的新焦點，因此本實驗旨在研究新型抗腫瘤血管生成藥物apatinib與經(jīng)典化療藥物5-Fu聯(lián)合對乳腺癌MCF-7細胞凋亡的影響，為其臨床聯(lián)合用藥提供體外實驗的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人乳腺癌細胞株MCF-7(西安交通大學醫(yī)學院醫(yī)學中心實驗室惠贈)；阿帕替尼(Apatinib)(江蘇恒瑞公司)；5-Fu(江蘇倍達醫(yī)藥科技有限公司)，DMEM培養(yǎng)基(美國GIBCO公司)；胎牛血清(以色列Biological Industries公司)；噻唑蘭(MTT)(美國sigma公司)；二甲基亞砜(DMSO)(美國sigma公司)；Annexin V-APC/7-AAD雙染凋亡試劑盒(深圳晶美生物公司)；細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；Genios 多功能酶標儀(美國TECAN公司)；FACScan 流式細胞儀(美國BD公司)；電泳和轉膜裝置(美國BIO-RAD 公司)；Odyssey 雙色紅外熒光成像系統(tǒng)掃描儀(美國LI-COR公司產(chǎn)品)；倒置顯微鏡(DXM1200)(日本Nikon 公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 對乳腺癌細胞MCF-7采用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待其貼壁生長至70%～80%時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。取對數(shù)生長期的細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2 藥物稀釋方法 將Apatinib藥物用100 % DMSO溶解配置成母液，保存于-20 ℃條件下。實驗用時稀釋，使DMSO溶液終濃度<0.5%，不影響細胞生長。

1.2.3 藥物干預分組 共分為4組，根據(jù)文獻資料回顧及預實驗結果分別設：空白對照組、apatinib單藥組、5-FU單藥組、apatinib+5-FU聯(lián)合組4組。檢測細胞增殖抑制率時apatinib濃度為：2.5、5、10、20、40 μmol/L，檢測細胞周期時apatinib濃度為：0、2、4、8 μmol/L，檢測細胞凋亡時apatinib單藥組濃度為5 μmol/L，5-FU單藥組濃度為2 μg/mL，聯(lián)合組中藥物所加的濃度與單藥組相同，對照組不加任何藥物做參考。

1.2.4 檢測項目及方法 MTT法檢測細胞活性，計算細胞抑制率。取對數(shù)生長期的乳腺癌細胞MCF-7(5 000個細胞/孔)接種于96孔板上，每孔加入100 μl細胞懸液，培養(yǎng)24 h后，傾去培養(yǎng)基，將經(jīng)處理的不同濃度(2.5、5、10、20、40 μmol/L)的阿帕替尼分別加入孔內(nèi)，每組設6個復孔，每孔加100 μl。以與實驗組中含有最大濃度DMSO的培養(yǎng)液為空白對照組，不含細胞的無血清培養(yǎng)基為調零孔，分別于培養(yǎng)24、48、72 h后每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)10 μL，繼續(xù)孵育4 h后終止培養(yǎng)，小心吸去藥液及培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min，充分溶解結晶物。用酶標儀在490 nm處測定OD值。細胞抑制率(%)=(1-試驗孔平均OD值/對照孔平均OD值)×100%，根據(jù)上述結果繪制細胞生長抑制率曲線。所有實驗均重復3次。

流式細胞儀檢測細胞周期：取對數(shù)生長期的MCF-7細胞，以2 mL/孔接種至6孔板內(nèi)，使細胞終濃度為2×105/ml，DMEM培養(yǎng)基孵育24 h后，實驗組分別加入不同濃度的apatinib(0,2,4,8 μmol/L)，每組設3個復孔，然后置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h后,收集各處理組細胞，用4 ℃預冷的PBS洗滌細胞2次，棄去上清，用預冷的70%乙醇固定，4 ℃保存，檢測前去除固定液，加入RNA酶工作液及碘化丙啶，4 ℃避光染色30 min，過300目濾網(wǎng)后上流式細胞儀，數(shù)據(jù)經(jīng)計算機處理，分析得出細胞周期各時相比例，所有試驗均重復3次。

流式細胞儀檢測細胞凋亡：取對數(shù)生長期的MCF-7細胞，以2 mL/孔接種至6孔板內(nèi)，使細胞終濃度為2×105/ml，含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基孵育24 h后，實驗組分別加入apatinib、5-FU單藥及兩藥聯(lián)合，對照組不加任何藥物作為參考，每組設3個復孔，然后置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后,以不含EDTA的胰酶消化各處理組細胞并收集，用4 ℃預冷的PBS洗滌細胞2次，離心后棄去上清，加入500 μl的Binding Buffer懸浮細胞，分別加入5 μl Annexin V-APC和5 μl的7-AAD染液，混勻室溫避光放置15 min后上流式細胞儀檢測，所有試驗均重復3次。

1.3 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 18.0統(tǒng)計分析軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 apatinib對MCF-7細胞毒作用

MTT法檢測apatinib對MCF-7細胞毒作用，結果發(fā)現(xiàn)，不同濃度的apatinib作用于MCF-7乳腺癌細胞24～72 h后，其生長抑制率見表1，繪制生長抑制曲線如圖1，提示阿帕替尼在體外對MCF-7細胞有明顯的生長抑制作用，其抑制率隨濃度增加而升高，呈明顯的時間-劑量依賴關系。

2.2 apatinib不影響MCF-7的細胞周期分布

經(jīng)終濃度為0、2、4、8umol/L的apatinib處理的MCF-7細胞，其G0/G1期細胞比例分別為48.53%、46.35%、48.21%、49.33%，S期細胞比例分別為49.12%、52.57%、50.43%和50.45%，G2期細胞比例分別是2.35%、1.08%、1.36%、1.23%，可見，隨著apatinib濃度的增加，MCF-7細胞周期的分布并沒有受到影響，apatinib并不是細胞周期特異性藥物。

表1 apatinib對MCF-7的細胞毒作用

圖1 不同濃度apatinib對MCF-7細胞的抑制作用

2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡結果

MCF-7細胞分別經(jīng)處理48 h后，采用Annexin V-APC/7-AAD法經(jīng)流式細胞儀測定細胞凋亡。結果發(fā)現(xiàn)：對照組、apatinib單藥組、5-Fu單藥組，apatinib+5-Fu聯(lián)合組細胞凋亡率分別為：7.73%、12.05%、25.76%、34.90%(圖2)；單藥處理組及聯(lián)合處理組與對照組進行兩兩比較，細胞凋亡率均有升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 apatinib、5-Fu單藥及聯(lián)合對MCF-7細胞凋亡率的影響

3 討論

乳腺癌的靶向治療是指針對乳腺癌發(fā)生、發(fā)展調控分子通路的靶點在細胞分子水平上設計的相應藥

物，通過與調節(jié)分子或受體結合，抑制這些下游基因的活化或受體的表達，使腫瘤細胞生長抑制或凋亡。細胞凋亡失控是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的1個重要環(huán)節(jié)，腫瘤細胞抵抗凋亡是腫瘤細胞耐受各種抗腫瘤治療如放療、化療并影響預后的重要原因[3]。Apatinib是1種新型的小分子酪氨酸酶抑制劑，在小鼠腫瘤模型顯示了抗腫瘤活性，選擇性抑制血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR-2)磷酸化及抗血管新生[4]。在臨床前研究中，apatinib在胃癌、結直腸癌、肝癌、肉瘤及非小細胞肺癌等多種移植瘤小鼠模型中均有明顯的抑瘤作用，且與奧沙利鉑、氟尿嘧啶、阿霉素及多西他賽聯(lián)合應用在上述移植瘤鼠模型上有協(xié)同作用[5-6]。最近有文獻報道在實體瘤的體外研究中發(fā)現(xiàn)apatinib可以逆轉P-gp介導的腫瘤多藥耐藥，apatinib可以增加ABCB1底物長春新堿、紫杉醇和阿霉素對ABCB1/P-gp高表達人乳腺癌耐藥細胞株MCF-7/Adr的細胞毒性[7-8]。已經(jīng)完成及正在進展的多項3期臨床試驗中，apatinib治療晚期胃癌、非小細胞肺癌及肝癌均顯示有較好的疾病控制率及可耐受的不良反應[9-10]。

近年的研究認為由于細胞周期紊亂、周期失控引起細胞無限生長，最終導致細胞惡性轉化，化療藥物可通過將腫瘤細胞停滯于G0/G1期，阻止細胞進入S期，從而抑制腫瘤細胞分裂，發(fā)揮抗腫瘤活性，本實驗采用流式細胞儀檢測處理后MCF-7細胞周期分布，結果顯示，經(jīng)不同濃度apatinib處理的各組細胞，其細胞周期各期比例并無統(tǒng)計學差異，因此我們認為apatinib對MCF-7細胞發(fā)揮抑制作用并不影響其細胞周期。

氟尿嘧啶類化療藥物在早期乳腺癌術后輔助治療、乳腺癌復發(fā)轉移后姑息治療中占有重要地位。該藥是細胞周期特異性藥物，其主要作用是在體內(nèi)經(jīng)酶轉化為5-氟脫氧尿嘧啶核苷酸而具有抗腫瘤活性，5-FU通過抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶而抑制DNA的合成。本研究將apatinib與5-Fu聯(lián)合起來，經(jīng)過流式細胞儀檢測，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合組細胞凋亡比例明顯高于apatinib單藥組及5-Fu單藥組，且3組用藥組與對照組之間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。我們的研究結果提示，apatinib和5-Fu聯(lián)合應用在一定程度上使抗腫瘤活性增強，這為臨床上治療乳腺癌采用生物化學治療模式提供了一定的參考，后續(xù)我們將對其可能的抗腫瘤機制做進一步的研究，為該方案的臨床應用提供更加充分的實驗證據(jù)。

A為對照組，B為apatinib組，C為5-Fu組，D為apatinib+5-Fu組

[1] Chen W,Zheng R,Zhang S,et al.Annual report on status of cancer in China〔J〕.Chin J Cancer Res,2014,26(1):48-58.

[2] Chen p,Iruela AL,Lou L,et al.VEGFR inhibitor YN968D1 xenograft dose response studies against human colon cancer Lsl74t and HT29〔J〕.Proc Amer Assoc Cancer Res,2006,47(9):1764-9.

[3] Oliveras FC,Vazquez MA,Cufi S,et al.Inhibitor of apoptosis(IAP) survivin is indispensable for survival of HER2 gene-amplified breast cancer with primary resistance to HER1/2-targeted therapies〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2011,407(2):412-419.

[4] Li J,Zhao XM,Chen L,et al.Safety and pharmacokineties of novel selective vascular endothelial growth factor receptor-2 inhibitor YN968D1 in patients with advanced malignancies〔J〕.BMC Cancer,2010,10(5):529-534.

[5] Yan JM,Yong JL,Hong BH,et al.Apatinib(YN968D1) Reverses Multidrug Resistance by Inhibiting the Efflux Function of Multiple ATP-Binding Cassette Transporters〔J〕.Cancer Res,2010,70(20):7981-7991.

[6] Fan M,Zhang J,Wang Z,et al.Phosphorylated VEGFR2 and hypertension:potential biomarkers to indicate VEGF-dependency of advanced breast cancer in anti-angiogenic therapy〔J〕.Breast Cancer Res Treat,2014,143(1):141-151.

[7] Allikmets R,Schriml LM,Hutchinson A,et al.A human p- lacenta-specific ATP-binding cassette gene (ABCP)on chromosome 4p22 that is involved in multidrug resistance〔J〕.Cancer Res,1998,58(23):5337-5339.

[8] Doyle LA,Yang W,Abruzzo LV,et al.A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells〔J〕.Proc Nati Acad Sci USA，1998，95(26):15665-15670.

[9] Kessler T,Fehrmann F,Bieker R,et al.Vascular endothelial growth factor and its receptor as drug targets in hematological malignancies〔J〕.Curr Drug Targets,2007,8(3):257-268.

[10] Scott AJ,Messersmith WA,Jimeno A.Apatinib.A promising oral antiangiogenic agent in the treatment of multiple solid tumors〔J〕.Drugs Today (Barc),2015,51(4):223-229.

(編輯：吳小紅)

Inhibitive Effects of Apatinib and 5-Fu on Breast Cancer Cell Line ECA109 in Vitro

ANGaili,LIXu，F(xiàn)ENGLu，etal.

ShaanxiProvincialPeople'sHospital,Xi'an,710068

Objective To investigate the inhibitive effects of Apatinib and 5-Fu on breast cancer cell line MCF-7 cells.Methods MCF-7 cells were treated with Apatinib at different concentrations and different times,cell growth inhibition was assessed by MTT,the cell cycle changes of the cells in response to apatinib treatment were observed by flow cytometry.MCF-7 cells were divided into 4 different groups:the control group,Apatinib group,5-Fu group and Apatinib + 5-Fu group.The cell apoptosis was detected by flow cytometry via Annexin V-APC/7-AAD double staining after 48 hours.Results Apatinib significantly inhibited the proliferation of MCF-7 cells in vitro,and the inhibition effects presented with time-and dose-dependent response,but produced no significant effect on the cell cycle.Apatinib+5-Fu treatment obviously increased the apoptotic rate of the MCF-7 cells,the difference has statistical significance compared with the control group(P<0.05).Conclusion Apatinib and 5-Fu can enhance the anti-tumor activity through inducing cell apoptosis.

Apatinib;5-Fluorouracil;MCF-7;Cell proliferation;Cell apoptosis

710068 陜西省人民醫(yī)院(安改麗，白 俊)；710061 陜西省腫瘤醫(yī)院(李 旭)；710061 西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院(安改麗，馮 璐，黃尚科，趙新漢)

趙新漢

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.05.002

R737.9

A

1001-5930(2017)05-0702-04

2016-05-24

2017-03-08)