miR-124對非小細胞肺癌細胞增殖的影響及其機制

寧衛衛 曾園園 朱健潔 劉澤毅 郭圓圓 黃建安

·基礎研究·

miR-124對非小細胞肺癌細胞增殖的影響及其機制

寧衛衛 曾園園 朱健潔 劉澤毅 郭圓圓 黃建安

目的 探討miR-124對非小細胞肺癌(NSCLC)細胞增殖的影響及其機制。方法 采用CCK8法和克隆形成實驗評估miR-124對細胞增殖能力的影響。采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot檢測miR-124轉染后細胞內PIM3的表達水平。通過雙熒光素酶報告系統檢測miR-124對PIM3熒光素酶活性的影響，證實miR-124可靶向作用于PIM3的3’UTR區。采用qRT-PCR和Western blot檢測si-PIM3轉染后細胞內PIM3的表達情況，采用CCK8法和克隆形成實驗檢測沉默PIM3后對細胞增殖能力的影響。結果 ①miR-124模擬物組的細胞活性(OD值)低于其對照組，差異有統計學意義，且呈時間依賴性；miR-124模擬物組的克隆形成數明顯少于其對照組。②miR-124模擬物組的miR-124過表達后，其PIM3表達低于其對照組，差異有統計學意義。③含野生型結合位點(PIM3 3’UTR區完整片段)的miR-124模擬物組的熒光素酶活性低于其對照組，差異有統計學意義；含突變型結合位點(PIM3 3’UTR區突變片段)的兩組無明顯差異。④si-PIM3組的PIM3被沉默后，其表達水平明顯低于其對照組，差異有統計學意義；si-PIM3組的細胞活性(OD值)低于其對照組，差異有統計學意義，且呈時間依賴性；si-PIM3組的克隆形成數明顯少于其對照組。結論 miR-124可通過靶向作用于PIM3的3’UTR區下調后者的表達而抑制NSCLC細胞的增殖。

非小細胞肺癌；miR-124；PIM3；細胞增殖

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:697～701)

MicroRNAs (miRNAs)是1類長約20～25 bp的非編碼RNA，其可通過與下游靶基因的mRNA進行堿基互補配對，而從轉錄后水平影響靶基因表達。現已證實，miRNA與腫瘤的發生發展關系密切。其中，miR-124被認為在多種實體腫瘤的發生發展過程中擔任著“抑癌基因”的角色。例如miR-124可抑制腫瘤細胞的增殖[1-2]，促進腫瘤細胞的凋亡[3-4]，以及抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移等[5-8]。本研究中，我們通過TargetScan 6.2在線軟件預選出PIM3作為miR-124的靶基因之一，并通過雙熒光報告載體系統和細胞實驗證實了miR-124對PIM3的作用機制以及對非小細胞肺癌(NSCLC)細胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞培養

人NSCLC細胞株A549購買自中國科學院上海細胞研究所。細胞培養在含10 %胎牛血清(FBS)、L-谷氨酰胺和抗生素的RPMI-1640 medium(購自美國HyClone公司)中，置于37 ℃含5 %CO2的細胞培養箱中。

1.2 RNA提取，cDNA合成及實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

用RNAiso Plus試劑盒(購自日本TaKaRa公司)提取所培養細胞的總RNA。用Reverse Transcriptase M-MLV試劑盒(購自日本TaKaRa公司)進行逆轉錄合成cDNA。用于qRT-PCR的miR-124的引物序列由廣州銳博公司合成；PIM3引物序列如下：正向5’-AAGCTCATCGACTTCGGTTC-3’，反向5’-GAGGATCTCCTCGTCCTGCT-3’；GAPDH引物序列如下：正向：5’-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3’，反向：5’-GGCATGGACTGTGGTCATGG-3’。 用SYBR Premix ExTaqTM試劑(購自日本TaKaRa公司)，基于ABI StepOne Plus Real-Time PCR系統(購自美國Applied Biosystems公司)進行qRT-PCR反應。反應程序如下：50 ℃，2 min；預變性95 ℃，10 min；然后變性95 ℃，15 s；退火延伸60 ℃，1 min；一共進行40次循環。每次在延伸階段讀取熒光值。PIM3和miR-124的mRNA值分別以內參GAPDH和U6作為標準化參照，其相對表達量用2-ΔΔCt(Ct代表循環閾值)值計算表示。

1.3 構建PIM3 3’UTR-熒光素酶報告載體，瞬時轉染和熒光檢測

我們先用TargetScan 6.2在線軟件預選出PIM3基因3’UTR區內可以與miR-124相結合的一片段，然后將該段序列以原序列或將其突變的方式進行合成延伸，最后亞克隆到psiCHECK2載體中。用miR-124模擬物(購自上海吉瑪公司)、miR-NC(購自購自上海吉瑪公司)和Lipofectamine 2000(購自美國Invitrogen公司)瞬時轉染A549細胞株48 h后，收集細胞。用購自美國Dual-Luciferase Report Assay試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.4 細胞增殖檢測

瞬時轉染48h后，將A549細胞株接種到96孔板中(2×103個細胞/孔)，每組設3個平行復孔，并設置調零孔(不接種細胞，僅加入RPMI 1640培養基)。用Cell Counting Kit-8 檢測試劑盒(購自中國武漢博士德公司)分別檢測接種24 h、48 h和96 h后的細胞活性。檢測時每孔加10 μl CCK8檢測試劑，于37 ℃孵育4 h后，用酶標儀測定450 nm波長的吸光度值(OD值)。

1.5 細胞裂解和Western-Blot實驗

當A549細胞在細胞培養瓶中長到80 %～90 %時，用RIPA buffer(購自美國Cell Signaling Technology公司)和蛋白酶抑制劑以及磷酸酶抑制劑(購自美國Sigma公司)裂解細胞，收獲蛋白質。 SDS-PAGE電泳分離蛋白質；蛋白質轉移到硝酸纖維素膜上；免疫反應(一抗、二抗孵育)；化學發光(ECL試劑盒)；顯影和定影。一抗濃度(抗β-actin單抗為1∶3000，抗PIM3多抗為1∶1000)，二抗濃度(山羊抗鼠為1∶2000，山羊抗兔為1∶2000)。ECL試劑盒購自美國Thermo Scientific公司；一抗(抗PIM3多體、抗β-actin單體)和辣根過氧化物酶標記的二抗(山羊抗鼠、山羊抗兔)均購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 miR-124對NSCLC細胞增殖的影響

將miR-124及其對照模擬物瞬時轉染A549細胞株后，采用qRT-PCR和CCK8法檢測，結果顯示miR-124過表達(圖1A)可以明顯抑制細胞增殖，且呈時間依賴性(圖1B)。克隆形成實驗也證實了這一點(圖1C)。

2.2 miR-124直接作用于PIM3的3’UTR下調其的表達

用TargetScan 6.2在線軟件預測并選出PIM3可能是miR-124調控的下游靶基因之一，然后通過細胞轉染實驗發現，miR-124的過度表達可明顯抑制腫瘤細胞內PIM3的表達。為了探討miR-124對PIM3的作用機制，用miR-124結合位點的PIM3 3’UTR片段的原序列(野生型)和突變序列(突變型)分別亞克隆到psiCHECK2雙熒光載體中，將由此得到的重組載體與miR-124模擬物或其對照模擬物共同瞬時轉染到A549細胞株中。后續的熒光素酶活性檢測結果顯示，具有野生型結合位點的miR-124模擬物組的熒光素酶活性較對照組明顯減弱，而突變型結合位點的miR-124模擬物組與對照組的熒光素酶活性無明顯差異，表明miR-124可以直接特異性地結合到PIM3的3’UTR區。因此，這些結果強有力地證明了miR-124可通過直接作用于PIM3的3’UTR區而下調后者的表達。

2.3 miR-124和PIM3對NSCLC細胞增殖的影響

將si-PIM3及其對照模擬物瞬時轉染A549細胞株后，采用CCK8法檢測，結果顯示PIM3被沉默后(圖2 A,B)，腫瘤細胞的增殖能力均明顯減弱，且呈時間依賴性(圖2C)。類似的結果也出現在miR-124及其對照組模擬物轉染細胞后的CCK8檢測結果(圖1B)及克隆形成實驗的結果中(圖1C,2D)。綜上，推斷miR-124可通過削弱PIM3的“促癌”作用而抑制NSCLC細胞增殖。

A為qRT-PCR檢測；B為CCK-8檢測；C為克隆形成實驗。

3 討論

非小細胞肺癌(NSCLC)是目前世界上最常見的肺癌類型(>80 %)，其傳統治療手段包括手術、放療、化療，但其5年中位生存率仍然僅為10 %左右[9]。近年來，分子靶向治療已成為非小細胞肺癌最熱門也最具前景的研究領域，其相關驅動基因包括EGFR、KRAS、ELM4-ALK、cMET、ROS1、RET等。但是此類患者往往需承擔更加高昂的藥物費用，且大多也會在一到兩年內因出現耐藥而“無藥可醫”。因此，探索非小細胞肺癌的發病機制及尋找新的診斷和治療方向很有必要。MicroRNAs(miRNAs)是真核生物體內一類長約20～25個核苷酸的內源性非編碼RNA。成熟的miRNAs可通過與其下游靶基因的mRNA進行堿基互補配對，從而使后者發生降解、影響其穩定性或抑制其表達。1種miRNA可有多個靶基因，而多種miRNA也可作用于同1個靶基因。其中，miR-124是一類在哺乳動物神經系統表達含量最豐富的miRNA，在原腸胚形成和神經發育過程中發揮重要作用。多項研究證實，miR-124多種類型實體腫瘤中低表達，如結腸癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌等[1-2,4]。近期，Yayun Zhang等[10]和Xie Chao等[11]研究結果顯示miR-124在NSCLC組織和細胞株中低表達，且與NSCLC轉移和預后密切相關。同時，后者的進一步研究表明miR-124可直接與其下游靶基因SOX8 mRNA的3’UTR結合，從而抑制NSCLC細胞增殖。Li XiuMei等[12]研究表明，miR-124可通過靶向作用于STAT3而抑制NSCLC細胞增殖，并可作為術后患者的一項預后指標。Yingjia Sun等[13]證實NF-κB介導的miR-124在淋巴結轉移的NSCLC中低表達；而miR-124可通過靶向作用于MYO10，抑制NSCLC細胞的侵襲和轉移。另外，Lidong Zu等[14]發現miR-124和TGF-β信號通路之間存在的反饋回路可能參與NSCLC的轉移過程。因此，與其他類型腫瘤一樣，miR-124在NSCLC中呈低表達，其可通過作用于其下游的多種靶基因抑制腫瘤細胞增殖，并可作為NSCLC靶向治療和判斷預后的一項潛在指標。

A、B分別為qRT-PCR和Western blot檢測；C、D分別為 CCK8法和克隆形成實驗。

本研究中，我們通過TargetScan 6.2在線軟件預測并選出PIM3作為miR-124的下游靶基因之一。PIM3是原癌基因PIM3家族的新成員，與其余兩個成員PIM1和PIM2有著高度同源的基因序列。因此PIM家族的生物學特性很相似，均可以表達絲/蘇氨酸激酶活性，磷酸化多種特異性底物，調控細胞周期和凋亡。目前認為PIM3發揮生物學功能主要有以下幾個途徑：通過磷酸化Bad或上調Bcl-2表達，抑制細胞凋亡；磷酸化P27、P21、Cdc25A、Cdc25C、C-TAK1等，加速細胞周期進程；通過調控AMPK、c-Myc和PGC-α或磷酸化EIF4B，提高蛋白合成；通過SOCS6抑制Erk1/2，從而抑制胰島素分泌；調控內皮細胞擴散、遷移和增殖以及胚胎干細胞的自我更新；調節Myc的轉錄活性等[15]。因此，PIM3的異常表達勢必參與腫瘤的發生發展，如促進腫瘤增殖、侵襲和轉移，抑制腫瘤細胞凋亡及誘導腫瘤血管生成等[16]。現已證實，PIM3在多種腫瘤，尤其是在內胚層衍生器官發生的腫瘤中異常高表達，如肝癌、胰腺癌和結腸癌等。然而，PIM3與肺癌的相關性研究鮮有報道。羅強等[17]和倪志強等[18]研究發現PIM3在體外肺癌細胞系和術后肺癌組織中的表達明顯高于癌旁組織和正常組織，且與腫瘤分化程度和淋巴結轉移密切相關，而與肺癌類型等其他臨床病理特征無關。同時后者還發現PIM3可能參與抑制非小細胞肺癌細胞凋亡；何凌云等[19]認為PIM3和Cdk-2可協同高表達參與肺鱗癌的發生發展過程。

另外，近期有學者用雙熒光素酶報告系統篩選出miR-15a/b、miR-16、miR-33a/b、miR-124、miR-195和miR-506能通過直接靶向作用于PIM3的3’UTR而抑制其熒光素酶活性，同時通過細胞實驗證實miR-506可下調PIM3表達而抑制胰腺癌細胞增殖[20]。本研究中，我們用TargetScan 6.2在線軟件和雙熒光素酶報告系統預選和證實了PIM3也是miR-124的下游靶基因之一，且首次證實在NSCLC細胞中，miR-124可通過下調PIM3表達而抑制腫瘤細胞增殖。因此，如果能進一步通過動物實驗和臨床試驗證實，miR-124很可能成為治療NSCLC的新靶點之一。然而，不同miRNA與多種靶基因形成的調控網絡極其龐大和復雜，且它們在不同腫瘤中的作用亦可有差別，因此miR-124及其靶基因在NSCLC中的作用機制和潛在價值仍需進一步研究和探索。

[1] Zhang J,Lu Y,Yue X,et al.MiR-124 suppresses growth of human colorectal cancer by inhibiting STAT3〔J〕.PLoS One,2013,8(8):e70300.

[2] Feng T,Xu D,Tu C,et al.MiR-124 inhibits cell proliferation in breast cancer through downregulation of CDK4〔J〕.Tumour Biol,2015,36(8):5987-5997.

[3] Li Y,Zhang Z,Liu X,et al.miR-124 functions as a tumor suppressor in the endometrial carcinoma cell line HEC-1B partly by suppressing STAT3〔J〕.Mol Cell Biochem,2014,388(1-2):219-231.

[4] Geng S,Zhang X,Chen J,et al.The tumor suppressor role of miR-124 in osteosarcoma〔J〕.PLoS One,2014,9(6):e91566.

[5] Xu X,Li S,Lin Y,et al.MicroRNA-124-3p inhibits cell migration and invasion in bladder cancer cells by targeting ROCK1〔J〕.J Transl Med,2013,11(1):276.

[6] Liang YJ,Wang QY,Zhou CX,et al.MiR-124 targets Slug to regulate epithelial-mesenchymal transition and metastasis of breast cancer〔J〕.Carcinogenesis,2013,34(3):713-722.

[7] Hu CB,Li QL,Hu JF,et al.miR-124 inhibits growth and invasion of gastric cancer by targeting ROCK1〔J〕.Asian Pac J Cancer Prev,2014,15(16):6543-6.

[8] Sun Y,Ai X,Shen S,et al.NF-kappaB-mediated miR-124 suppresses metastasis of non-small-cell lung cancer by targeting MYO10〔J〕.Oncotarget,2015,6(10):8244-54.

[9] Malvezzi M,Bertuccio P,Levi F,et al.European cancer mortality predictions for the year 2012〔J〕.Ann Oncol,2012,23(4):1044-1052.

[10] Zhang Y,Li H,Han J.Down-regulation of microRNA-124 is correlated with tumor metastasis and poor prognosis in patients with lung cancer〔J〕.Int J Clin Exp Pathol,2015,8(2):1967-1972.

[11] Xie C,Han Y,Liu Y,et al.miRNA-124 down-regulates SOX8 expression and suppresses cell proliferation in non-small cell lung cancer〔J〕.Int J Clin Exp Pathol,2014,7(11):7518-7526.

[12] Li X,Yu Z,Li Y,et al.The tumor suppressor miR-124 inhibits cell proliferation by targeting STAT3 and functions as a prognostic marker for postoperative NSCLC patients〔J〕.Int J Oncol,2015,46(2):798-808.

[13] Sun Y,Ai X,Shen S,et al.NF-kappaB-mediated miR-124 suppresses metastasis of non-small-cell lung cancer by targeting MYO10〔J〕.Oncotarget,2015,6(10):8244-8254.

[14] Zu L,Xue Y,Wang J,et al.The feedback loop between miR-124 and TGF-beta pathway plays a significant role in non-small cell lung cancer metastasis〔J〕.Carcinogenesis,2016,37(3):333-343.

[15] Li YY,Mukaida N.Pathophysiological roles of Pim-3 kinase in pancreatic cancer development and progression〔J〕.World J Gastroenterol,2014,20(28):9392-9404.

[16] Yang H,Wang Y,Qian H,et al.Pim protein kinase-3 is regulated by TNF-alpha and promotes endothelial cell sprouting〔J〕.Mol Cells,2011,32(3):235-241.

[17] 羅 強,熊 暢,熊 珊,等.Pim-3在肺癌組織中的表達〔J〕.華南國防醫學雜志,2012,26 (1)：16-18.

[18] 倪志強,方艷秋,譚 巖,等.Pim-3在非小細胞肺癌中的表達及臨床意義探討〔J〕.當代醫學,2012,18 (36):24-25.

[19] 何凌云,黃健輝,劉永春,等.Pim-3、Cdk-2蛋白在肺鱗癌中的表達及其意義〔J〕.咸寧學院學報,2012,26 (2):104-107.

[20] Du J,Zheng X,Cai S,et al.MicroRNA506 participates in pancreatic cancer pathogenesis by targeting PIM3〔J〕.Mol Med Rep,2015,12(4):5121-5126.

(編輯：吳小紅)

Effect of miR-124 on Cell Proliferation of Non-small Cell Lung Cancer and ItsMechanism

NINGWeiwei,ZENGYuanyuan,ZHUJianjie,etal.

TheFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou,215006

Objective To study the effectof miRNA-124 on cell proliferation of non-small cell lung cancer(NSCLC) and its mechanism.Methods The CCK8 assay and colony formation assay were employed to evaluate the impact of miR-124 on cell proliferation.Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) and western-blot were used to detect PIM3 expression in the cells transfected with miR-124.The dual luciferase reportor gene assay was performed to detect the influence of miR-124 upon PIM3 luciferase activity,which demonstrated that miR-124 specifically could bind to PIM3 3’UTR.The PIM3 expression in the cells transfected with si-PIM3 was detected with qRT-PCR and western-blot,while effect of PIM3 silencing on cell proliferation was assessed by CCK-8 assay and colony formation assay.Results ①The cell viability (OD value) in miR-124 mimics group was lower than the control group,with statistically significant difference,and in a time-dependent manner.The colony-forming populations of cultural cells in miR-124 mimics group were significantly less than the control group.②PIM3 expression of cells in miR-124 mimics group was lower than the control group,with statistically significant difference,after overexpression of miR-124 in the experimental group.③The luciferase activity of PIM3 with intact 3’UTR region (wildt-ype) in miR-124 mimics group was lower than the control group,and the difference was statistically significant.While no difference was shown in the luciferase activity of PIM3 with mutant 3’UTR region (mutant-type) between the experimental group and the control group.④PIM3 expression of cells in si-PIM3 group (kockdown group) and si-NC group were statistically different.The cell viability (OD value) in si-PIM3 group was lower than the control group,with statistically significant difference,in a time-dependent manner.And the colony-forming populations of cultural cells in si-PIM3 group were extremely less than the control group.Conclusion miR-124 can directly bind to 3’UTR of PIM3,thus reducing PIM3 expression to inhibit proliferation of NSCLC cells.

Non-small cell lung cancer(NSCLC);miR-124;PIM3;Cell proliferation

國家自然科學基金(編號：31270940)，蘇州市臨床醫學中心(編號：Szzx201502)

215006 蘇州大學附屬第一醫院(寧衛衛，曾園園，朱健潔，劉澤毅，郭圓圓，黃建安)；215006 蘇州大學呼吸疾病研究所(曾園園，朱健潔，劉澤毅，黃建安)

黃建安

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.05.001

R734.2

A

1001-5930(2017)05-0697-05

2016-04-11

2017-03-28)