自噬介導FAS/AD抑制Bel-7402細胞的增殖

王 玉 呂艷欣 劉 軍 夏春輝 孫東升 謝立平

(齊齊哈爾醫學院，黑龍江 齊齊哈爾 161000)

自噬介導FAS/AD抑制Bel-7402細胞的增殖

王 玉 呂艷欣 劉 軍1夏春輝 孫東升 謝立平

(齊齊哈爾醫學院，黑龍江 齊齊哈爾 161000)

目的 探討在FAS/AD抑制Bel-7402細胞增殖過程中自噬的作用。方法 通過MTT法檢測3-甲基腺嘌呤(3-MA)對細胞增殖的影響,通過免疫熒光法檢測LC3及Beclin 1的表達變化，通過Western印跡檢測Atg12-5和Atg7的表達，以揭示FAS/AD對Bel-7402細胞的自噬作用。結果 與對照組相比,FAS/AD組的細胞的自噬現象明顯,LC3及Beclin 1高表達，同時Atg12-5和Atg7也高表達，而FAS/AD/MA組的活力明顯降低，自噬現象較弱，同時LC3、Beclin 1及Atg12-5和Atg7的表達降低。結論 3-MA能明顯減弱FAS/AD誘導的細胞自噬作用，且自噬介導FAS/AD抑制BEL-7402細胞增殖。

FAS抗體;放線菌素D;自噬;凋亡

通常細胞內自噬維持在很低的水平,但是在應激條件下被誘導,它在細胞內起著各種各樣的功能〔1〕。研究發現,在多種人類腫瘤中均存在自噬活性的改變。在肝癌、胰腺癌以及乳腺癌中,腫瘤細胞的自噬活性比其來源的正常細胞的自噬活性要低,自噬具有維持基因組的穩定性的功能從而抑制腫瘤的發生〔2,3〕。凋亡是抑制腫瘤發生的一個重要機制,在腫瘤細胞中,自噬在某些情況下能夠增加細胞的凋亡〔4〕。雖然現在許多證據表明自噬具有腫瘤抑制的功能,但是不可否認,自噬可以促進腫瘤的存活，可能是由于自噬具有細胞保護作用和營養的回收再利用的功能〔5〕。在營養缺乏的條件下,抑制自噬可以誘導Bel-7402細胞的凋亡。因此,自噬在腫瘤的發生過程中起著雙重的作用,它在腫瘤發生過程中的具體機制還需要更加進一步的研究。本課題組研究發現FAS/AD通過誘導Bel-7402細胞凋亡從而抑制細胞增殖，同時出現了細胞自噬的現象，自噬是促進細胞增殖還是抑制細胞增殖，這是我們所感興趣的，因此我們利用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)的作用通過自噬的標志物LC3、Beclin 1〔6〕及自噬相關蛋白Atg〔7〕的變化研究自噬與細胞增殖的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 MTT和胰酶購自Sigma公司；DMEM培養基購自Gibco公司；FAS抗體購自Cell Signaling Technology公司；LC3、Beclin 1及Atg5,7,12抗體和二抗購自Santa cruz公司；Actinomycin D(AD)購自CalBio-chem；Bel-7402細胞購自中科院動物研究所。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將Bel-7402細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，加入青霉素100 U/L、鏈霉素100 mg/L，置37℃、5% CO2的培養箱中培養。取對數生長期的細胞隨機分成:對照組;FAS/AD組;FAS/AD/MA組。換液2 h后進行處理，FAS/AD組：在Bel-7402細胞中添加FAS抗體(6 μmol/L) 和 AD(20 μmol/L)。FAS/AD/MA組：在Bel-7402細胞中添加FAS抗體(6 μmol/L)、AD(20 μmol/L)和3-MA(5 mmol/L)。

1.2.2 MTT檢測細胞的生長情況 取對數生長期的Bel-7402細胞用胰酶消化后接種于96孔板，每孔為1×104個細胞，置于CO2培養箱中培養。24 h細胞完全貼壁后換液，2 h后加藥，每個濃度設三個平行孔，培養6,12,24 h后加5 g/L MTT 20 μl，再培養4 h后每孔加150 μl DMSO，10 min后待藍紫色結晶物質溶解后酶標儀檢測，波長為雙波長570 nm和630 nm。細胞活力=(實驗組A/對照組A)×100%〔8〕。當細胞活力<30%為高度敏感，30%≤細胞活力<50%為中度敏感，50%≤細胞活力≤70%為低度敏感，細胞活力>70%為不敏感。

1.2.3 Western印跡方法檢測蛋白表達 各組細胞藥物作用24 h后收集細胞,提取總蛋白檢測LC3及Beclin 1。 用Lowry法測定含量蛋白經 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉移至醋酸纖維素膜上,用含 50 g/L奶粉的TBST室溫封閉1 h;分別加一抗(1∶1 000稀釋),在4℃冰箱過夜;用TBST漂洗 10 min×3次;加1∶5 000稀釋的過氧化物酶結合的二抗,室溫孵育1 h;用TBS漂洗10 min×2次,TBST漂洗10 min×1次,ECL發光 。

1.3 統計學方法 采用SPSS18.0軟件進行方差分析。

2 結 果

2.1 3-MA對細胞活力的影響 將不同濃度的3-MA作用于Bel-7402細胞24 h，通過MTT實驗，根據酶標儀的吸光度值對細胞活力進行評價，7.5 μmol/L(78.63%±1.37%)和10 μmol/L(49.97%±1.57%)對細胞活力影響最大，差異明顯。當3-MA 的濃度為7.5 μmol/L時P=1.13×10-5,當3-MA 的濃度為10 μmol/L時P=6.49×10-7，而0 μmol/L(100%)、2 μmol/L(99.12%±0.61%)、5 μmol/L(98.93%±0.71%)的3-MA對細胞活力無影響(P>0.05)，因而選定5 μmol/L的3-MA進行后續的實驗。將5 μmol/L的3-MA作用于FAS/AD刺激的Bel-7402細胞，分別作用6 h、12 h、24 h、48 h，3-MA作用24 h時FAS/AD刺激下Bel-7402細胞活力下降明顯(P=0.000 1)。見表1。

表1 3-MA對FAS/AD作用下的Bel-7402 細胞活力的影響

與FAS/AD組比較：1)P<0.01

2.2 FAS/AD誘導LC3及Beclin 1的表達 在對照組LC3幾乎檢測不到，Beclin 1有微弱的表達，當FAS/AD作用后LC3(紅)與Beclin 1(綠)都有表達且很明顯，說明自噬已經發生，當添加了3-MA后，這種自噬現象反倒減弱了，說明3-MA能降低FAS/AD引起的細胞自噬現象，見圖1。

2.3 FAS/AD影響Atg12-5、Atg7的表達 從圖2中可以看到對照組Atg12-5的表達很低，而FAS/AD組表達很高，二者差異顯著，而3-MA作用后能明顯降低Atg12-5的表達。同樣Atg7在對照組表達非常低，而在FAS/AD組強表達，在FAS/AD/MA組表達降低，根據以上結果得出FAS/AD能誘導細胞產生自噬作用，且能被自噬抑制劑3-MA減弱。

1:對照組；2:FAS/AD組；3:FAS/AD/MA組；A:LC3表達(紅色)；B:Beclin 1表達(綠色)；C:LC3與Beclin 1共表達(黃色)圖1 LC3與Beclin 1在Bel-7402細胞內的表達

1～3：對照組、FAS/AD組、FAS/AD/MA組圖2 各組Atg12-5、Atg7的表達

3 討 論

細胞的死亡形式分為凋亡性程序性細胞死亡、自噬性程序性細胞死亡和細胞壞死三種類型〔9〕。程序性死亡(PCD)對于腫瘤細胞的惡性增殖至關重要。傳統的腫瘤治療方案主要以凋亡為靶標，但是腫瘤發生過程中凋亡受抑已經是被廣泛認知的重要事件。清除癌細胞不能僅僅通過凋亡性死亡，還可以通過其他死亡方式比如自噬性死亡來實現，自噬可抑制癌細胞發生凋亡性死亡〔10〕。

本課題已證明FAS/AD是通過誘導Bel-7402細胞凋亡抑制細胞增殖的〔11〕，同時伴有自噬現象,當自噬特異性抑制劑3-MA作用后，FAS/AD抑制增殖的作用反而增強了，說明自噬介導FAS/AD對細胞增殖的抑制作用。因而我們應用自噬的特異性的自噬抑制劑3-MA來進一步探討自噬在FAS/AD抑制Bel-7402細胞增殖中的作用。3-MA通過抑制m型PI3K的活性起作用，并且可以干擾微管相關蛋白LC3定位于自噬體膜，從而干擾自噬體的形成，因此本文清楚地觀察到FAS/AD誘導LC3和Beclin 1的表達，但這種表達可被3-MA部分抑制。LC3定位于前自噬泡和自噬泡膜表面，參與自噬體的形成，現已作為自噬體的特異性標記蛋白〔12〕。自噬相關基因Beclin 1基因也稱BECNI基因是哺乳動物參與自噬的特異性基因，作為調節自噬的重要因子之一，Beclin 1的表達水平一定程度上反映了自噬的活性〔13〕。LC3與Beclin 1作為自噬的標志蛋白，他們的檢測是細胞發生自噬的有力證據。

細胞自噬的整個過程被進化上高度保守的一系列自噬相關基因Atg所控制。在哺乳動物的自噬泡形成過程中，由Atg12-5和LC3參與組成的兩條泛素樣蛋白加工修飾過程，對自噬復合體的形成具有關鍵作用,Atg12-5結合過程與前自噬泡的形成相關〔7〕。Atg7是 Atg12-5和 LC3 兩條泛素樣蛋白通路位置上游的蛋白質分子，是自噬過程的必須蛋白分子，阻斷后可以顯著減少自噬性細胞死亡的發生。本文顯示，FAS/AD促進Atg12-5的高表達，同時Atg7也表達，但是3-MA作用后Atg12-5與Atg7的表達都降低，FAS/AD誘導的細胞自噬作用可被3-MA減弱。

1 Hale AN,Ledbetter DJ,Gawriluk TR,etal.Autophagy regulation and role in development〔J〕.Autophagy,2013;9(7):951-72.

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7 Romanov J,Walczak M,Ibiricu I,etal.Mechanism and functions of membrane binding by the Atg5-Atg12/Atg16 complex during autophagosome formation〔J〕.EMBO J,2012;31(22):4304-17.

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13 付 俊,尚海旭,賈弘禔,等.Beclin1 與自噬及腫瘤的關系〔J〕.生理科學進展,2012;43(2):155-8.

〔2015-12-13修回〕

(編輯 曹夢園)

黑龍江省教育廳科學技術研究項目(No.12521616)

夏春輝(1969-)，男，博士，教授，碩士生導師，主要從事光敏劑對腫瘤細胞的影響研究。

王 玉(1970-)，女，博士，主要從事腫瘤細胞信號轉導研究。

R854

A

1005-9202(2017)08-1847-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.011

1 齊齊哈爾大學