比索洛爾對大鼠肝微粒體細胞色素P450酶含量及其不同亞型活性的影響

劉明遠 李 萌 趙可欣 韓 梅 趙錦程 張明遠 朱秋雙 楊 玉 白 雪 楊光遠

(佳木斯大學基礎醫學院藥理學教研室，黑龍江 佳木斯 154007)

比索洛爾對大鼠肝微粒體細胞色素P450酶含量及其不同亞型活性的影響

劉明遠 李 萌 趙可欣 韓 梅1趙錦程 張明遠 朱秋雙 楊 玉 白 雪 楊光遠

(佳木斯大學基礎醫學院藥理學教研室，黑龍江 佳木斯 154007)

目的 探討比索洛爾對大鼠肝微粒體細胞色素P450酶 (CYP450) 含量及CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4活性的影響。方法 生理鹽水為對照，大鼠灌胃給予0.9 mg·kg-1·d-1的比索洛爾，連續7 d，然后測定其肝微體中CYP450含量及CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4活性。結果 與對照組比較，比索洛爾組CYP450含量和CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4活性的差異無統計學意義(P>0.05)。結論 比索洛爾對CYP450含量和CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4活性無影響。

比索洛爾；CYP450；CYP1A2；CYP2C9；CYP2C19；CYP2D6；CYP3A4

比索洛爾為選擇性β1-受體阻斷劑〔1〕，主要用于高血壓、心絞痛、心律失常及心力衰竭等心血管系統疾病的治療〔2〕，也可輔助用于甲亢治療。臨床上常與其他抗心血管藥物及抗甲狀腺功能亢進藥物聯合應用。肝細胞色素P450 (CYP450) 為Ⅰ相藥物代謝酶，是參與外源性物質生物轉化的重要酶系。多種化學物質對CYP450酶可產生誘導或抑制作用，因而改變CYP450 酶的含量或活性，并進一步影響CYP 450 酶對其底物的生物轉化〔3〕。多種藥物聯合應用在臨床很常見，但因此而產生的藥物之間的相互作用(DDI)也隨之增長〔4〕。研究發現，兩種藥物合用發生DDI的風險為13%，若同時服7種或以上藥物，則DDI發生率將會上升到82%〔5〕。長期用藥對CYP450酶的抑制或誘導是DDI的重要機制之一。關于比索洛爾直接給藥對CYP450酶各亞型的作用國內外文獻鮮見報道。本實驗旨在探討比索洛爾對肝CYP450酶的影響及其DDI的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料 動物：清潔級雄性Wistar大鼠，體重200～250 g〔購自哈爾濱醫科大學實驗動物學部，合格證號：SCXK-(黑)2013-001)〕。主要試劑與儀器：富馬酸比索洛爾(批號：100711-200401，含量>98%，中國食品藥品檢定研究院)；非那西丁、對乙酰氨基酚、甲苯磺丁脲、美芬妥英、異喹胍、4′-羥基甲苯磺丁脲、4′-羥基美芬妥英、4′-羥基異喹胍、1′-羥基咪達唑侖(Sigma公司)；咪達唑侖(批號：171270-201402，含量>98%，中國食品藥品檢定研究院)；三重四極桿串聯質譜儀(QTRAP型，美國Applied Biosystem公司)；高效液相色譜系統(Agilent 1100，美國Agilent公司)；紫外分光光度計〔Unico uv-2100，尤尼柯(上海)儀器有限公司〕。

1.2 方法

1.2.1 給藥方案 24只Wistar大鼠，隨機分成3組，每組8只。對照組和比索洛爾給藥組分別灌胃給予生理鹽水和富馬酸比索洛爾0.90 mg/kg，連續給藥7 d。苯巴比妥誘導組于其他兩組給藥的第5天開始腹腔注射苯巴比妥鈉75 mg/kg，連續給藥3 d。

1.2.2 肝微粒體的制備 拉頸椎處死動物后迅速取出肝臟，放置于冰冷的0.25 mol/L蔗糖溶液(pH7.4)中，剪碎，洗至無血色；取2 g加1.0 ml蔗糖溶液，用組織勻漿機在冰浴中制成勻漿；4℃下首先20 000 r/min離心20 min，然后取上清液于100 000 r/min離心60 min，所得沉淀在0.1 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.4)中懸浮均勻，-80℃保存。依據文獻方法進行蛋白濃度測定〔6〕。

1.2.3 CYP450含量測定 用Tris-HCl緩沖液將肝微粒體樣品蛋白稀釋至0.3～0.5 mg/ml，依據文獻方法〔7〕，將少量Na2S2O4加入樣品池后，再通CO氣體30 s，并分別記錄450 nm和490 nm的吸光度。CYP450 (nmol/mg protein)=〔A (450-490)×1 000〕/(91×C)。A(450-490)為450 nm及490 nm的吸光度差，C為被測樣品蛋白的濃度(mg/ml)。采用雙樣本分析，計算平均值。

1.2.4 CYP450酶各亞型活性測定 參照文獻方法〔8～11〕，分別以非那西丁、甲苯磺丁脲、美芬妥英、異喹胍和咪達唑侖作為CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4的底物，建立500 μl孵育體系，各成分終濃度如表1。孵育10 min，取樣100 μl加入到 200 μl冰冷甲醇中以終止反應。分別建立定量測定對乙酰氨基酚、4′-羥基甲苯磺丁脲、4′-羥基美芬妥英、4′-羥基異喹胍和1′-羥基咪達唑侖的高效液相色譜串聯質譜分析方法(樣品處理過程及質譜、色譜條件略)，通過計算不同代謝物的生成速度來評價CYP450酶各亞型的活性。分別以相應的各探針藥物的代謝產物對乙酰氨基酚、4′-羥基甲苯磺丁脲及 4′-羥基美芬妥英、4′-羥基異喹胍和1′-羥基咪達唑侖的產率(單位：nmol·mg-1· min-1) 作為 CYP1A2、 CYP2C9 、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4 酶活性指標。

表1 CYP450酶各亞型活性測定反應體系

1.3 統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行ANOVA檢驗和t檢驗。

2 結 果

2.1 肝微粒體CYP450含量 與對照組〔(0.76±0.20)nmol/mg〕比較，比索洛爾組CYP450 含量〔(0.77±0.14)nmol/mg〕差異無統計學意義(P>0.05)；苯巴比妥組〔(1.53±0.39)nmol/mg〕明顯高于對照組(P<0.01)。

2.2 CYP450各亞型活性比較 比索洛爾組與對照組大鼠肝微粒體CYP1A2、CYP2C9、 CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4 活性差異均無統計學意義(P>0.05)。說明比索洛爾對CYP1A2、CYP2C9、 CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4 亞型活性沒有抑制或誘導作用。見表2。

表2 CYP450酶各亞型活性

3 討 論

聯合用藥時由于一種藥物對CYP450酶特定亞型的誘導或抑制，從而影響經該CYP450酶亞型代謝的其他藥物的代謝速度，導致DDI發生。近年來，心血管系統疾病已成為危害人類健康的常見病、多發病，由于老年人是心血管病的主要發病群體且常常合并其他疾病，心血管病人常常服用多種藥物，因此抗心血管病藥物與其他藥物合用在老年人中更為常見。作為治療心血管系統疾病的常用藥，比索洛爾在臨床上廣泛應用，與其他藥物聯合用藥的概率非常大。

有研究表明，3個CYP450酶亞型家族(CYP1、CYP2和CYP3)可參與95%的外源化合物的代謝〔12〕。本實驗結果提示當比索洛爾與主要經CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4代謝的藥物合用時，具有臨床意義的藥物相互作用發生的可能性較小。比索洛爾口服給藥后對CYP450酶各亞型的影響，目前文獻報道甚少，Hefner等〔13〕表明比索洛爾對CYP2D6無臨床意義的抑制作用，與本實驗結果一致。本實驗分別以非那西丁、甲苯磺丁脲、美芬妥英、異喹胍和咪達唑侖作為CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4的特異性底物，通過測定相應的代謝產物對乙酰氨基酚、4′-羥基甲苯磺丁脲、4′-羥基美芬妥英、4′-羥基異喹胍和1′-羥基咪達唑侖的生成速度來評價CYP450酶各亞型的活性。該法具有肝微粒體制備容易、孵育條件易優化、重現性好等優點。但藥物對 CYP450 酶的作用存在一定的種屬差異性〔14〕。比索洛爾對人肝微粒體 CYP450 酶各亞型的作用，還有待于進一步研究考證。

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〔2016-11-08修回〕

(編輯 曲 莉/滕欣航)

黑龍江省留學歸國人員科學基金(LC2016039)；佳木斯大學重點項目(Szj2008-015)

楊光遠(1975-)，男，主任醫師，碩士生導師，主要從事心血管藥理學研究。

劉明遠(1973-)，女，副教授，主要從事心血管藥理學研究。

R969.2

A

1005-9202(2017)08-1836-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.006

1 佳木斯大學附屬第一醫院