Hep2-exo負載樹突細胞誘導抗喉癌免疫效應的機制

張瓊宇 李 培 葵 旭 胡曉軍 孫遠東

(永州職業(yè)技術學院基礎醫(yī)學部，湖南 永州 425100)

Hep2-exo負載樹突細胞誘導抗喉癌免疫效應的機制

張瓊宇 李 培 葵 旭 胡曉軍 孫遠東1

(永州職業(yè)技術學院基礎醫(yī)學部，湖南 永州 425100)

目的 探討人喉癌細胞Hep2細胞來源外泌體(Hep2-exo)負載樹突細胞(DC)后體外刺激細胞毒T細胞對Hep2細胞的殺傷作用。方法 利用蔗糖密度梯度超速離心法從Hep2細胞培養(yǎng)上清液中分離Hep2-exo。透射電子顯微鏡鑒定Hep2-exo形態(tài)，Western印跡分析Hep2-exo表面CD9分子表達。分離培養(yǎng)喉癌患者外周血單個核細胞誘導的DC，流式細胞術鑒定細胞表型。用MTT法檢測負載Hep2-exo的DC刺激T淋巴細胞增殖情況及細胞毒T細胞對Hep2細胞的殺傷作用。結果 透射電鏡下見Hep2-exo呈典型的杯狀,大小相對均一，平均直徑30～100 nm。Hep2-exo表面有CD9CD63分子表達。單個核細胞DC有CD1a分子表達說明誘導成功，邊緣有絨毛樣突起，呈典型的PC形態(tài)。負載Hep2-exo的DC刺激T細胞增殖能力及T細胞對靶細胞的殺傷效應明顯強于未負載Hep2-exo的DC(P<0.05)。結論 負載Hep2-exo的DC 能促進T細胞增殖，可體外誘導細胞毒T細胞應答抑制喉癌細胞生長。

喉癌；外泌體；Hep2細胞裂解物；樹突細胞；T細胞

外泌體是一種小型的細胞膜包裹的結構，是細胞分泌到細胞外的納米級小囊泡，為脂質雙層膜包裹的扁平球體，呈杯狀，直徑約在30～100 nm。多種類型細胞均能以這種胞外分泌的方式釋放外泌體(Exo)〔1〕。腫瘤細胞來源外泌體(Texo)富含主要組織相容性復合體(MHC)分子、腫瘤相關抗原(TAA)、共刺激分子等分子，能夠誘導抗腫瘤相關的細胞毒性 T 細胞(CTL)應答反應〔2〕，但是效率較低，難以達到治療和預防腫瘤的效果。所以，增強Texo誘導的抗腫瘤效應是開發(fā)以Texo為基礎的高效腫瘤疫苗的關鍵。來源于抗原提呈細胞(APC)的Exo能夠有效刺激 T淋巴細胞的體外增殖，并且可以誘導機體內的抗腫瘤免疫反應。包含腫瘤抗原的Texo可以通過 APC 交叉呈遞給CTL，使其產生腫瘤殺傷CTL反應。研究顯示，Texo能夠在體內靶向結合樹突細胞(DC)，靶向結合的DC可誘導較腫瘤裂解物負載DC更強的免疫應答反應〔3〕。從人喉癌細胞株Hep2細胞分離Hep2-exo，體外與DC共同培養(yǎng)，使之負載。本文主要探討Hep2-exo負載DC后誘導CTL，從而對Hep2細胞生長產生抑制的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗相關細胞 Hep2購自中科院腫瘤細胞庫。新鮮喉癌患者全血由中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院提供。

1.2 試劑與儀器 胎牛血清購自杭州四季青公司；Ficoll淋巴細胞分離液購于北京鼎國生物科技有限公司；重組人白細胞介素(rhIL)-4、重組人粒細胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、腫瘤壞死因子(TNF)-α細胞因子購于派普泰克公司；辣根過氧化物酶標記二抗購自Sigma公司；人-CD1a-APC,人-IgG1-APC抗體和人-CD14 磁珠均購自德國美天旎公司；人CD9單克隆抗體購自武漢博士德公司；

1.3 Hep2-exo的分離 將Hep2細胞用含 10% 胎牛血清的二甲基亞砜(DMEM)培養(yǎng)液于37℃、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)。選取對數生長期細胞，收集細胞培養(yǎng)上清液10 ml，3 000 r/min離心15 min，去除細胞或細胞碎片。將上清液轉移至另一干凈的滅菌管中加入2 ml ExoQuick試劑，上下顛倒離心管混勻。4℃孵育過夜(12 h)后,1 500 r/min離心30 min，管底可見米白色沉淀，去除上清后，1 500 r/min繼續(xù)離心5 min，小心再次去除上清。取適量磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸，通過二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白含量，后用0.22 μm濾器進行過濾除菌，然后進行分裝，進行功能實驗。

1.4 利用透射電鏡研究Hep2-exo 形態(tài)特征 將獲得樣品用超速離心機10 000 r/min離心10 min，棄掉上清，用2.5%戊二醛固定。經過PBS漂洗；1%四氧化鋨(OsO4)固定；PBS漂洗，酒精丙酮梯度脫水，浸透，包埋聚合，然后制備70 nm超薄切片，醋酸鈾-檸檬酸鉛染色，JEM-1200EX(日本JEOL公司)鏡下觀察，拍片。

1.5 Western印跡分析CD9分子表達 首先進行Hep2細胞計數，然后取1×108/ml個Hep2細胞，液氮反復快速凍融4次，然后1 000 r/min離心30 min，所獲得的上清液即為細胞裂解物抗原，通過BCA法進行蛋白定量。按40 μg蛋白上樣量，取Hep2-exo及Hep2細胞裂解物，將樣品加入上樣緩沖液進行煮沸變性，12%十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離，將目的蛋白轉移至醋酸纖維膜上，在室溫下經過5% 脫脂奶粉封閉2 h后，加入一抗(1∶1 000)4℃ 過夜，PBS洗滌3次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶5 000)，37℃孵育1 h，PBS洗滌3次，每次10 min，加入化學發(fā)光液(美國賽默飛公司)曝光顯影。

1.6 單核細胞來源DC的誘導培養(yǎng) 取喉癌患者新鮮抗凝人外周血加入PBS，混勻后在離心管底部加入Ficoll淋巴細胞分離液，首先300 r/min離心30 min，收集乳白色細胞層，適量PBS洗滌后，300 r/min離心25 min，收集細胞。PBS重復洗滌，計數后備用，此為外周血單個核細胞。利用CD14細胞磁珠分選系統分離CD14+細胞，然后進行凍存同一樣本的CD14-細胞。將收集的CD14+細胞用進行細胞計數。加入細胞因子rhGM-CSF 1 000 IU/ml，rhIL-4 1 000 IU/ml，TNF-α 1 000 IU/ml。將CD14+細胞(1×106/ml/孔)接種于12孔細胞培養(yǎng)板中。在培養(yǎng)的第3天補加相同濃度細胞因子，第7天時，取其中一個孔中1×105個細胞進行流式細胞術檢測表達CD1a，鑒定細胞為DCs。其中另兩孔用Hep2-exo(10 μg)負載DC培養(yǎng)48 h，使之成為Hep2-exo-DC。

1.7 T淋巴細胞增殖實驗 將對應同一個體CD14-細胞復蘇，并且用含有10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液重懸細胞，進行細胞計數后加入尼龍毛柱中。經過常規(guī)細胞培養(yǎng) 1 h后，收集 T 淋巴細胞，計數并進行增殖實驗。實驗分為3組，將DC與T淋巴細胞(T)按1∶3(105/孔∶3×105/孔)比例混合培養(yǎng)，A組：Hep2-exo-DC + T；B組：DC+T；C組：T。96 孔培養(yǎng)板(100 μl/孔)中接種各組細胞，設置3個復孔，37℃、5% CO2培養(yǎng)72 h每孔加入20 μl噻唑藍(MTT)，孵育4 h后，每孔再加入150 μl DMSO，混勻后，通過酶標儀(Thermo Scientific Varioskan Flash)于波長570 nm測定吸光度值。

1.8 細胞毒性實驗 設實驗組、效應細胞對照組、Hep2靶細胞對照組、DC對照組和陰性對照組，實驗組為Hep2-exo-DC + T (比例為1∶3)，T淋巴細胞為效應T細胞，實驗組按效靶比12.5∶1，25∶1，50∶1，加入已鋪好靶細胞的Hep2細胞(1×104/孔)的96孔培養(yǎng)板，每孔100 μl，每組設5個復孔。所有孔在IL-2(400 U/ml)條件下，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，加入MTT溶液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后加入DMEM 150 μl，于波長490 nm測定A值，計算殺傷活性：CTL殺傷活性(%)=〔靶細胞對照組A值-(實驗組A值-效應細胞對照組A值)〕/靶細胞對照組A值× 100%。

2 結 果

2.1 Hep2-exo的鑒定結果 Hep2細胞分泌的Exo呈圓形或橢圓形，大小相對均一，其外可見有脂質膜包裹，內部為低電子密度物質，平均直徑30～100 nm，同國外文獻報道〔1,2〕一致。Hep2細胞裂解物和Hep2-exo均表達CD9和CD63分子，Hep2-exo表達CD9和CD63灰度值比Hep2細胞裂解物高。見圖1，圖2。

2.2 DC表型分析 來源于PBMC的CD14+經過細胞因子(rhGM-CSF,rhIL-4,TNF-α)誘導培養(yǎng)至第7天，顯微鏡見大部分細胞貼壁生長，出現毛刺樣突起，呈現典型的樹枝狀突樣。通過流式細胞儀分析顯示DCs表面高表達CD1a分子，則證明DC誘導成功。見圖3。

圖1 Hep2細胞來源Exo電鏡圖(×20 000)

圖2 Western印跡結果分析

圖3 DC的形態(tài)與表型鑒定

2.3 Hep2-exo負載DC刺激T淋巴細胞增殖 相比僅有T細胞的對照組(0.26±0.14)，Hep2-DC + T組(1.76±0.17)和DC+T組(7.20±0.17)的T淋巴細胞數量明顯增加(P<0.05)。此結果說明負載Hep2-exo的DC和未負載Hep2-exo的DC具有刺激T 細胞活化增殖能力。而且Hep-exo-DC + T組同DC + T 組相比，Hep-exo-DC + T組具有更強的增殖能力，說明負載Hep2-exo的 DC 與未負載 Hep2-exo的DC相比，刺激 T 細胞活化的能力更強(P<0.05)。

2.4 Hep2-exo致敏DC誘導CTL的特異性殺傷作用 負載Hep2-exo的 DC 在效靶比為12.5∶1時，其抗Hep2細胞能力與未負載Hep2-exo的 DC、Hep2-exo、 T 細胞對照組相比差異無統計學意義；但是在效靶比25∶1，50∶1時，負載Hep2-exo的DC 誘導 CTL 抗Hep2細胞能力明顯高于其他三組。在效靶比50∶1時，抗Hep2細胞活力能力最高。見圖4。

圖4 Hep2-exo負載 DC 誘導特異性CTL活性

3 討 論

作為生長在人頭頸部的惡性腫瘤，根據我國數據統計，喉癌發(fā)病率占全身惡性腫瘤的1%～2%，然而其占耳鼻喉科惡性腫瘤的發(fā)病率達到了10%～12%，并且出現逐年增高的趨勢〔4〕。在目前的技術下，主要以手術臨床治療喉癌，并且以放療和化療進行輔助治療。但是這有許多缺點，由于腫瘤易復發(fā)和轉移，最主要的是放療和化療缺乏針對性的治療，并且不能明顯提高喉癌患者的生存率和生活質量。在國內外，生物免疫治療已經成為腫瘤的第四種治療模式，并且已經在進行臨床試驗。例如利用 DC能夠有效特異性遞呈抗原的生物學特性，激活初始型T淋巴細胞，使其活化為抗原特異的CTL誘導患者機體產生腫瘤特異性的持久免疫應答。

Texo作為多種活細胞分泌的囊泡圓形或者橢圓形球體結構，但是其最終發(fā)揮的功能會因為細胞來源的不同而不同〔5～7〕。研究顯示，Texo含有MHC-Ⅰ類分子、熱休克蛋白、腫瘤相關抗原等〔8,9〕，并且存在腫瘤抗原運載系統(HSPs)以及與細胞靶向性有關的蛋白(CD9 和 CD63)。說明腫瘤Texo也是一種抗原傳遞系統，能夠將腫瘤抗原轉移到抗原遞呈細胞，能夠激活T淋巴細胞增殖和CTL反應，但是效率較低，難以達到治療腫瘤的效果。但是經DC攝取后，進而進行遞呈抗原，因此而激活 T 淋巴細胞反應，從而能夠表現出較強的抗腫瘤免疫效應〔10〕。本次研究中采用SBI公司ExoQuick試劑盒從Hep2細胞上清液提取外泌體，電鏡下見Hep2細胞分泌的呈圓形或橢圓，大小相對均一，其外可見有脂質膜包裹，內部為低電子密度物質，平均直徑30～100 nm，表面有CD9CD63分子表達，與國外文獻報道一致〔11〕。喉癌患者外周血單個核細胞經過細胞因子成功誘導成DCs后，然后用Hep2-exo進行體外刺激，研究負載Hep2-exo的DC激活T淋巴細胞增殖反應并且激活對喉癌細胞的殺傷效應。本研究結果Hep2-exo致敏DC能夠有效誘導T淋巴細胞活化增殖，CTL 被激活以后抑制Hep2細胞生長，發(fā)揮抗腫瘤作用。雖然Hep2-exo能夠繼承腫瘤細胞中的 MHC-Ⅰ類分子和腫瘤抗原，然而并不能有效激活誘導 CTL 反應，雖然目前研究用腫瘤抗原刺激DC后的外泌體誘導CTL抗腫瘤，但是因為其抗腫瘤效率不及DC〔12〕。因此選擇利用Texo負載DC，抑制腫瘤細胞增殖。因此通過研究結果推測，首先，T 淋巴細胞的活化增殖需要腫瘤抗原、MHC 分子的刺激，第二還需要 DC 等抗原提呈細胞提供共刺激信號。當這兩項條件滿足時，Hep2-exo負載到DC上時，才能高效誘導 CTL 反應，發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究利用最新的試劑盒方法成功地從分離了Hep2-exo，更有臨床意義的是證實了Hep2-exo負載DC可誘導 CTL反應，引起有效的抗腫瘤免疫效應，從而為喉癌的生物免疫治療提供臨床治療的基礎數據。

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〔2016-12-19修回〕

(編輯 袁左鳴)

永州市2015年度第二批指導性科技計劃項目(永科發(fā)〔2015〕10號)

孫遠東(1975-)，男，博士，副教授，主要從事細胞生物學領域研究。

張瓊宇(1982-)，男，博士，講師，主要從事發(fā)育生物學研究。

R73

A

1005-9202(2017)08-1827-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.003

1 湖南科技大學生命科學學院