腸道病毒71VP1基因的克隆與原核表達載體構建

王歡　薛健

摘要：手足口病是由人腸道病毒引起的一種兒童常見傳染病，主要由腸道病毒71型和柯薩奇病毒A組16型引起。近年來，尤其是腸道病毒71引發的手足口病在亞太地區呈上升趨勢。本研究采用RT-PCR技術，設計特異性引物擴增EV71VP1基因序列，克隆至原核表達載體pET32a（+）中，以期為今后腸道病毒EV71新型疫苗的開發提供技術基礎。

關鍵詞：手足口病；EV71；原核表達載體構建

中圖分類號：R725.1 文獻標識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20170132011

手足口病（Hand-foot-mouth Disease，HFMD）是由柯薩奇病毒A4、A5、A8、A10、A16、B3、B7和腸道病毒71型等多種人腸道病毒引起的一種兒童常見傳染病，其中引起手足口病疫情的病原體以腸道病毒71型（EV71）、柯薩奇病毒A組16型（cOXAl6）最為常見。大多數患者癥狀輕微，以發熱和手、足、口腔等部位的皮疹或皰疹為主要癥狀。通常情況下，兩者引起的手足口病在臨床癥狀等方面難以區別，但EV71感染除了引起HFMD外，還能夠引起無菌性腦膜炎、腦干腦炎和脊髓灰質炎樣麻痹等多種與神經系統相關的較為嚴重的癥狀。自1974年Schmidt等首次報道從美國加利福尼亞暴發表現為神經系統癥狀疾病的患者中分離到EV71病毒以來，EV71病毒已在世界范圍內引起十多次暴發與流行。近年來，EV71病毒的流行在亞太地區呈上升趨勢。自2008年3月以來，我國多個省份出現了手足口病的流行，引起社會高度重視。

由于手足口病潛伏期長，癥狀不明顯，不易被發現，因而極易延誤疾病治療，目前國內外尚無相關疫苗類藥物面世。EV71保守序列VPI編碼病毒結構蛋白，具備抗原特異性，本研究采用RT-PCR技術，設計特異性引物擴增EV71 VP1基因序列，克隆至原核表達載體pET32a（+）中，以期為今后腸道病毒EV71新型疫苗的開發提供技術基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

EV71病毒RNA、大腸桿菌DH5 α和原核表達載體pET32a（+）為本實驗室保藏；RT-PCR試劑、限制性內切酶EcoR I和Xho I購自寶生物工程（大連）有限公司；T4DNA連接酶，質粒提取試劑盒購自上海生工生物工程技術有限公司。

1.2引物設計

根據GenBank中EV71 VP1（AB204852.1）

基因序列（891bp），設計VP1上下游引物。上游引物：5-GGAATTCCTCTACCAGCACCCACAGGC-3（加入限制性酶切位點EcoR I）；下游引物：5-CTCGAGGCATCGGGCGAGGTATCCAC-3（加入限制性酶切位點Xho I）。

1.3VPl基因擴增

1.3.1反轉錄反應

10μL反應體系，其中病毒RNA 2.5μL，AMV反轉錄酶0.5μL，10×RT buffer2μL，dNTPMix 1μL，Oligo-dT 0.5μL，Rnaes抑制劑0.5～tL，Nuclease-free水3μL。70℃變性退火5min，42℃反轉錄反應45min，70℃保溫5min終止反應。

1.3.2PCR反應

50μL反應體系，10×buffer 5μL，dNTP 4μL，上下游引物各1μL，反轉錄產物5μL，DNA聚合酶1μL，雙蒸水33μL。反應條件：94℃預變性5min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30循環，72℃終延伸5min。產物使用瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.4pET32a（+）-VP1原核表達載體構建

擴增片段鑒定正確后，使用限制性內切酶EcoR I和Xho 1分別對VP1擴增片段與原核表達載體pET32a（+）進行雙酶切反應，反應條件為37℃，120min，65℃滅活20min。膠回收VP1擴增片段與pET32a（+）酶切產物，使用T₄DNA連接酶在16℃下進行連接反應，過夜。然后將連接產物轉化至大腸桿菌感受態細胞DH5 α后，挑取單克隆進行雙酶切鑒定后送至上海生工生物工程技術有限公司測序，測序結果通過Bioedit軟件比對。

2結果與分析

2.1VPl基因RT-PCR擴增產物的鑒定

VP1基因RT-PCR擴增產物經過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的條帶位于1200bp與800bp之間（圖1），與預期大小732bp一致。

2.2重組質粒pET32a（+）-VP1的鑒定

使用限制性內切酶EcoR I和Xho I對重組質粒pET32a（+）-VP1進行雙酶切，酶切產物經過0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，分別得到的2條產物片段大小與VPl片段和pET32a（+）載體大小一致，測序結果表明VPl片段與Genebank中的VP1序列同源性為99%，表明重組原核表達載體pET32a（+）-VPl構建成功。

本研究采用RT-PCR技術，設計特異引物擴增EV71VPl基因序列，通過限制性內切酶EcoR I和Xho I的雙酶切反應和T4DNA連接酶的連接反應，將VP1片段克隆至pET32a（+）中，經過雙酶切與DNA測序鑒定，表明VP1片段成功被克隆至原核表達載體pET32a（+）中。在本研究的基礎上，可以進一步進行VP1蛋白純化，抗血清制備及其免疫原性分析，從而為今后腸道病毒EV71新型疫苗的開發提供技術基礎。