山臘梅幾丁質酶基因的克隆及其植物表達載體的構建

于國云　于鑫銘　劉曉丹

摘要：本研究利用RT-PCR技術擴增山臘梅幾丁質酶基因，對幾丁質酶基因的序列進行生物信息學分析，同時成功構建植物表達載體，為植物幾丁質酶基因功能的研究提供理論基礎。

關鍵詞：山臘梅；幾丁質酶；基因克隆；植物表達載體

中圖分類號：Q344.13 文獻標識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20170132003

幾丁質酶不僅在植物抗真菌病害中起著重要的作用，而且在植物發育、生物固氮及抗逆等方面都發揮關鍵作用。特別是在病蟲害防治方面，采用生物技術的手段改良植物的抗病蟲害和抗逆的研究越來越多，且已取得了較為明顯的成果。目前已先后從小擬南芥、大白菜、菜豆、野生香蕉、紫花苜蓿、中國水仙等植物中克隆獲得幾丁質酶基因。隨著人們對其作用、特性、表達調控及轉基因的深入研究，使幾丁質酶基因成為植物分子生物學研究領域中重要的研究對象及作物抗真菌病害基因工程的研究熱點。

鑒于幾丁質酶基因在植物抗病及抗逆方面的作用，本研究以抗病蟲害及抗逆性較強的山臘梅為材料，通過RT-PCR的方法首次克隆得到山臘梅中的幾丁質酶基因，并對其進行生物信息學分析，進一步構建植物表達載體。研究結果豐富了植物幾丁質酶基因的研究，同時為通過植物基因工程手段提高植物的抗病蟲害及抗逆功能研究提供理論基礎。

1材料與方法

1.1材料

植物材料：山臘梅種子購自源茂種業，土培至長出幼苗（約2個月），取幼嫩葉片，5mm水楊酸處理4h后立即用液氮固定，置-80℃冰箱備用。

植物表達載體：pGFPGUSPlus由吉林大學植物科學學院提供。

主要試劑：Trizol試劑盒、TaqDNA聚合酶、DNAMarker、PCR產物回收試劑盒購自大連寶生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1山臘梅幾丁質酶基因的RT-PCR擴增

根據NCBI網站上檢索到臘梅幾丁質酶基因（FJ749130），設計特異性引物。以cDNA為模板進行RT-PCR擴增。

PCR產物進行1%凝膠電泳檢測，利用產物回收試劑盒純化目的片段。將純化的PCR產物送至測序公司進行測序。

1.2.2 山臘梅幾丁質酶基因的序列分析

對測序結果進行相關生物信息學分析，如幾丁質酶基因序列同源性比對、蛋白保守域分析，進一步使用MEGA5.05軟件構建系統進化樹。

1.2.3 植物表達載體的構建

將含有植物表達載體的菌落擴大培養，堿裂法提取質粒載體。將純化的PCR產物和表達載體同時用XbaI和SacI進行酶切，并用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠回收酶切后的目的基因和質粒。將目的基因和酶切質粒連接，轉化到感受態大腸桿菌中。對轉化子進行菌液PCR檢測，并對陽性轉化子菌液擴大培養，堿法提取質粒，進行雙酶切鑒定。

2結果與分析

2.1山臘梅幾丁質酶基因的克隆

以臘梅cDNA為模板，利用RT-PCR擴增獲得一條約1000bp的特異條帶（圖1），進一步進行測序。

2.2山臘梅幾丁質酶基因序列的生物信息學分析

測序結果分析表明山臘梅幾丁質酶基因全長為939bp，編碼312個氨基酸。蛋白分子量為32.9KD。核酸序列同源比對結果表明，山臘梅幾丁質酶基因與已公布的臘梅幾丁質酶基因（FJ560717及FJ749130）的同源性高達98%，與蒺藜苜蓿Medicago trtmcatula（Y10373）、馬鈴薯Solanum tuberosum（NM_001288193）、水稻Oryza sativa（XM_015788082）、辣椒Capsicumannuum（FJ596176）的同源性均為75%，與紫花苜蓿Medicago sativa（AY804254）的同源性為73%，與大麥Hordeum vulgare（AK358661）的同源性為65%。

幾丁質酶蛋白保守結構域分析表明（圖2），其編碼的肽鏈具有典型的糖苷水解酶19家族幾丁質酶結構域，該結構域中具有3個特征性的催化位點及6個推斷的幾丁質結合位點；該結構域與類溶菌酶超家族基因的保守結構域類似，推測該酶兼具溶菌酶活性。

根據幾丁質酶核酸序列比對的結果，在NCBI網站上檢索到11種不同植物的幾丁質酶基因核酸序列，采用Neighbor_joining方法構建系統進化樹。結果表明（見圖3），山臘梅（Chimonanthus nitens Oliv.）與臘梅（Chimonanthus praecox（Linn.）Link）聚類在同一個單源分支上，親緣關系最近；其次是外圍枝的馬鈴薯、菜豆、辣椒、水稻等。與野生香蕉的親緣關系最遠。

2.3植物表達載體的構建

菌液PCR驗證陽性克隆子，進一步提取陽性質粒進行雙酶切驗證，結果表明（如圖4），山臘梅幾丁質酶基因已成功插入到表達載體pGFPGUSPlus中。

3討論

隨著植物分子生物學技術的不斷發展，已有越來越多的幾丁質酶基因轉入不同作物中。迄今為止，已對許多幾丁質酶基因進行植物遺傳轉化，如水稻、煙草、黃瓜、香蕉、花生、番茄、玉米等。隨著對植物幾丁質酶基因的結構、修飾、作用機理及轉基因的深入研究，對幾丁質酶的生物學功能和生理作用更加了解，為進一步開發和利用幾丁質酶奠定堅實的基礎，幾丁質酶基因轉化作物的研究將更為實用化。我國對轉幾丁質酶基因防治真菌等病害的應用也將進入產業化，將為農作物的防病治病、增產增收做出貢獻。