亞臨界法提取神香草精油成分及抗氧化活性的研究

徐效圣，吳曉菊，陳亞麗

亞臨界法提取神香草精油成分及抗氧化活性的研究

徐效圣1，吳曉菊1，陳亞麗2

（1.新疆輕工職業技術學院食品生物技術學院，新疆烏魯木齊830021；2.中國科學院新疆生態與地理研究所，新疆烏魯木齊830011）

采用氣相色譜-質譜聯用技術（GC-MS）分析亞臨界萃取神香草中揮發油的化學成分和相對含量，并探討其化學成分與神香草特有香氣之間的關系，同時進行體外抗氧化能力試驗。結果表明，從揮發油中分離出46種化合物，鑒定出其中的30種，占揮發性成分總量的94.29%；揮發油的主要成分有三甲基二環[3,1,1]庚烷-3-酮（28.27%）、α-生育酚乙酸酯（16.89%）、硬脂酸乙烯酯（7.32%）；分析得出三甲基二環[3,3,1]庚烷-3-酮與α-生育酚乙酸酯是神香草精油獨特香氣的主要成分；神香草揮發油在DPPH自由基和羥自由基的清除作用方面表現出較高的活性。

神香草；揮發油；抗氧化；氣相色譜-質譜聯用；亞臨界萃取

0 引言

神香草是唇形科多年生草本（半灌木），在新疆的北部、內蒙古等地常見[1-2]，其作為維吾爾族民間常用草藥，維吾爾語名為“祖法依亞比斯”。《拜地依藥書》載：神香草是一種植物的全草，形狀與麥加指甲花和野指甲花相似，藥用家生神香草，具有消炎平喘、止咳化痰、祛寒止痛、通肝軟脾、利尿消腫、消除毒蟲之毒、驅除腸蟲的作用[3-4]，神香草含有黃酮類、三萜類、烷烴類、甾體類和揮發油等成分[5-6]。

神香草揮發油的提取有2種常用方法，分別是水蒸氣蒸餾法和有機溶劑浸提法。水蒸氣蒸餾法出油率僅在0.5%～0.7%，產品得率低，而且活性成分破壞多；有機溶劑方式萃取揮發油，在食藥等行業中的應用受限。超臨界CO2流體萃取法，雖具有很強的優勢，但是氣體必須在超高壓狀態下才能夠進行萃取加工，制約了其在工業上的應用。而亞臨界流體常溫常壓條件下是氣體狀態，因而大大降低了生產成本[7]。

試驗采用亞臨界萃取方式對神香草提取揮發油，從中鑒定出30種化合物。同時設計自由基清除能力試驗對其抗氧化活性進行分析，較系統地評價了神香草揮發油成分及其體外抗氧化能力，為神香草的商業化種植、神香草精油的高品質提取加工提供了理論數據基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

神香草，新疆伊犁地區第65團場種植；神香草揮發油，中國科學院新疆生態與地理研究所提供[7]；無水乙醚、鄰二氮菲、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼及其他試劑，均為分析純。

GCMS-5977型氣相色譜-質譜聯用儀，美國安捷倫科技有限公司產品；722-P型可見分光光度計，北京普析通用有限公司產品；RE-5298型旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠產品；亞臨界萃取設備，河南安陽晶華油脂有限公司產品。

AL204-IC型電子天平，FSH-2型高速勻漿機，HWS26型電熱恒溫水浴鍋，TGL-10C型高速臺式離心機，以及固相微萃取裝置和加熱蒸餾裝置。

1.2 試驗方法

1.2.1 亞臨界萃取神香草揮發油

將神香草葉和花于40℃條件下烘干處理72 h，烘干后粉碎過篩，取40目的粉末備用。采用亞臨界方式提取，詳見參考文獻[7]。

1.2.2 樣品處理及氣相色譜-質譜測定方法[8]

樣品預處理：采用針式固相微萃取處理（PDMS），使用前于280℃條件下老化30 min，放入樣品瓶，于40℃條件下預熱10 min，然后在40℃條件下萃取40 min后直接進樣，解析3 min。

色譜柱：30 m×0.25 mm，0.25 μm石英毛細管柱；升溫程序：60℃保持2 min，以4℃/min升至140℃保持2 min，再以6℃/min升至220℃保持8 min；檢測器：FTD；載氣：N2；靈敏度：32×10-12AFS；進樣量：1.0 μL；分流比：2∶1。

離子源：EI；能量：70 eV；進樣口溫度：230℃，接口溫度：230℃；電子倍增電壓：1.5 kV；溶劑延遲：6 min；掃描范圍：40～500 u。

1.2.3 風味物質分析方法

用氣相色譜質譜聯用儀分析鑒定神香草揮發油樣品溶液，得到總離子色譜圖。經計算檢索，同時對目標組分用峰面積歸一法進行積分計算，從而得出反應生成的各組分含量，確定神香草揮發油物質的化學成分。

1.2.4 抗氧化活性的測定

（1）DPPH自由基清除能力的測定。參照文獻[8-9]方法改進，分別配制質量濃度為0.01，0.02，0.03，0.04，0.05 mg/mL神香草揮發油及VC溶液，在一系列10 mL比色管中分別加入3.5 mL 1.0×10-4mol/L的DPPH溶液，然后加入0.5 mL無水乙醇，搖勻并反應30 min，以無水乙醇為參比，測定其于波長517 nm處的吸光度A1；同時用同樣方法測定3.5 mL 1.0×10-4mol/L的DPPH溶液和0.5 mL樣品液的吸光度A；測定3.5 mL無水乙醇與0.5 mL樣品液于波長517 nm處的吸光度A0，以相同質量濃度的VC溶液作陽性對照，所有操作重復測定3次。按照公式（1）計算DPPH自由基清除率。

（2）羥自由基清除能力的測定。參照文獻[10-11]方法改進，采用結晶紫法，配制0.05 mg/mL的VC和純化后神香草揮發油溶液。在中號比色管中加入0.2 mL 0.4 mmol/L的結晶紫，然后加入3 mL pH值4.0的磷酸氫二鉀-檸檬酸緩沖溶液，同時添加2 mL 15 mmol/L的FeSO4溶液和相同濃度、體積的H2O2溶液，緩沖溶液定容至10 mL，搖勻后放置30 min，于波長580 nm處測吸光度A0，同時測定不加H2O2時的吸光度Ab。試驗組中，加入H2O2之前，加入不同體積純化后神香草揮發油樣品液，測定其吸光度Ax，以相同質量濃度的VC溶液作陽性對照，所有操作重復測定3次。按照公式（2）計算羥自由基清除率。

2 結果與分析

2.1 神香草揮發油（亞臨界萃取）化學成分神香草揮發油的總離子流見圖1。

圖1 神香草揮發油的總離子流

經儀器所配置的LIB譜庫進行檢索，化合物通過保留指數進行定性，峰面積歸一化法進行定量。經鑒定，神香草揮發油共獲得30種化合物。

在上述條件下獲得的GC-MS圖譜，結合色譜保留規律，與NIST譜圖庫作對比。

由圖1可知，共分離出46個質譜峰，經檢索并結合參考相關文獻[12]，初步判斷出其中30種化合物成分。其中，以含碳、氫、氧的化合物為主，也有少量的物質含有氮等其他原子，包括4種烷烴類化合物（3種環烷烴和1種直鏈烷烴）、8種萜烯類化合物、4種酯類化合物、8種芳香族醇類化合物、4種酮類化合物、2種酸類化合物、1種生物堿類化合物。神香草揮發油獨特的香味即由上述物質呈現。

神香草揮發油的主要化學成分（亞臨界）見表1，三甲基二環[3,1,1]庚烷-3-酮的特征指紋見圖2，α-生育酚乙酸酯的特征指紋見圖3。

表1 神香草揮發油的主要化學成分（亞臨界）

圖2 三甲基二環[3,1,1]庚烷-3-酮的特征指紋

圖3 α-生育酚乙酸酯的特征指紋

通過表1，圖1和圖2分析，其中生物活性比較高的成分有十五烷、β-水芹烯、桃金娘烯醇、乙酸里哪酯、石竹烯、香樹烯、G-橄香烯、硬脂酸乙烯酯、α-生育酚乙酸酯、三甲基二環[3,1,1]庚烷-3-酮等。

通過峰面積可以判斷萜烯、酯酮類化合物是神香草揮發油的主要成分，其含量為三甲基二環[3,1,1]庚烷-3-酮（28.27%）、α-生育酚乙酸酯（16.89%）、硬脂酸乙烯酯（7.32%）。三甲基二環[3,1,1]庚烷-3-酮與α-生育酚乙酸酯是神香草精油獨特香氣的主要成分。

2.2 神香草揮發油對DPPH自由基的清除作用

通過前人的研究成果及DPPH自由基抗氧化物的供氫能力分析，它在有機溶劑波長517 nm處有強吸收[13]。在反應中，體系顏色變得越淺則表示檢測物質的抗氧化能力越強。

DPPH自由基清除率與樣品液質量濃度的關系見圖4。

圖4 DPPH自由基清除率與樣品液質量濃度的關系

由圖4可知，神香草揮發油具有清除DPPH自由基的作用，且隨質量濃度增加清除率增大；但與VC這種人工抗氧化劑相比，其清除效果仍然低于同質量濃度的VC。試驗表明，神香草揮發油符合隨質量濃度增加清除DPPH自由基能力增強的趨勢。2.3神香草揮發油對羥自由基清除能力的測定

羥自由基清除率與樣品液質量濃度的關系見圖5。

圖5 羥自由基清除率與樣品液質量濃度的關系

試驗采用結晶紫作為氧化還原指示劑，其顏色變化可敏銳地反映溶液氧化還原的狀態。由圖5可知，隨著神香草揮發油質量濃度增大羥自由基清除率也逐漸升高，說明神香草化學成分具有清除羥自由基的能力，但比VC的清除能力低。因此可知，神香草揮發油可以有效清除羥自由基，對人體健康有益。

3 結論

試驗以神香草揮發油為底物，使用GC-MS法分析了的其化學成分與含量，并鑒定出30種化合物成分，含量較多的化合物為酯類、烷烴類和萜類，相對含量最高的是三甲基二環[3,1,1]庚烷-3-酮和α-生育酚乙酸酯。祖麗菲亞·吾斯曼等人的研究結果與試驗有些差別，從維藥神香草超臨界CO2流體萃取經GC-MS分析、鑒定出所有34種化合物，其中γ-谷甾醇（31.882%）、二十八烷（19.953%）化合物含量最高。分析其產生較大差別的原因，可能是試驗所用的神香草揮發油采用亞臨界萃取制得，經文獻檢索報道較多的為水蒸氣提取制得；也可能因神香草的產地和品種不同，導致其揮發油化學成分有所差異。神香草揮發油成分的復雜性，為進一步合理開發利用神香草資源帶來一定的優勢。

揮發油是含有多種揮發性成分的復雜體系，其抗氧化活性是多種化學成分共同作用的結果。神香草揮發油對DPPH自由基和羥自由基的清除能力有一定影響，但明顯略弱于VC；作為一種多用途植物，其富含特有的活性物質及營養成分，具有抗氧化、防衰老、抑菌等多種生理功能，擁有廣闊的市場開發潛力和研究價值。目前，報道的文獻研究中較多的是化學成分的分析，對于其抗氧化方面報道較少，試驗對此部分進行了完善。神香草揮發油相應的生理活性、藥理作用尚不明確，還需要進一步研究。

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Studies on Chemical Components and in Vitro Antioxidant Capacity of Essential from Hyssopus with Subcritical Treatment

XU Xiaosheng1，WU Xiaoju1，CHEN Yali2
（1.College of Food and Biotechnology，Xinjiang Institute of Light Industry Technology，Urumqi，Xinjiang 830021，China；2.Xinjiang Institute of Ecology and Geography，Chinese Academy of Sciences，Urumqi，Xinjiang 830011，China）

Subcritical extraction followed by GC-MS combined with quantification by peak area normalization method is used to analyze volatile compounds in the fruitbodies of hyssopus.Meanwhile，the relationship between volatile compounds and characteristic aroma of the fruitbodies of hyssopus is explored.Hyssopus antioxidant activities are evaluated by this method.Results show that 46 compounds are identified，accounting for 94.29%of the total volatile compounds from the fruitbodies of hyssopus among which the predominant compounds are trimethylbicyclo[3,1,1]heptane-3-ketone（28.27%），D-alpha-Tocopheryl acetate（16.89%）and vinyl Stearate（7.32%）.Trimethylbicyclo[3,3,1]heptane-3-ketone and D-alpha-Tocopheryl acetate are mainly responsible for the characteristic aroma of the fruitbodies of hyssopus.The hyssopus shows high antioxidant activity，through the elimination of（DPPH）free radicals and hydroxyl radical.

hyssopus；volatile oil；antioxidant activity；gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）；subcritical extraction

R284.2

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.03.039

1671-9646（2017）03b-0043-04

2017-02-20

新疆維吾爾自治區高校科研計劃項目（XJEDU2014I066）。

徐效圣（1983—），男，碩士，講師，研究方向為食品質量與控制。