耐鉛細菌分離鑒定及生物學特性

趙娟娟+吳榮榮+李志濤

摘要：從河北省棗強縣受重金屬污染的土壤中分離得到2株耐鉛細菌，即ZQq1和DYq2，耐受鉛離子最高濃度分別為2.0、2.5 mmol/L，經鑒定為芽孢桿菌屬。2株菌的生物學特性研究表明，菌株ZQq1和DYq2在pH值4～10之間，鹽度不超過10%時能夠生長。菌株ZQq1最適pH值為8，最適生長溫度42 ℃，最適滲透壓為0%；菌株DYq2最適生長溫度為42 ℃，最適pH值為8，最適滲透壓為1%。

關鍵詞：耐鉛細菌；分離鑒定；生物學特性；芽孢桿菌

中圖分類號： S182文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）04-0215-02

伴隨著我國工業程度的加深，重金屬鉛對環境的破壞程度越來越嚴重。鉛可以通過汽車尾氣、印染企業廢棄物的排放、電池和電子產品的丟棄等各種途徑而傳遞到環境中，進入土壤和地下水中[1]。在被鉛污染的水體和土壤中，生長的各種生物通過富集作用，經過食物鏈傳遞，最終可以使大量鉛進入食物鏈的頂端包括人類。蓄積在人體內的鉛能對血液循環再生系統造成損傷，蓄積到一定的程度時，人就會表現出失眠、噩夢等癥狀，更有甚者會引起智力下降[2]。

[JP2]研究表明，微生物可降低環境中重金屬鉛的生物毒性，在用于土壤重金屬污染鉛的治理等方面的研究均取得了一定的成果[3]。從棗強工業區采集土樣，通過逐級分離篩選耐鉛細菌并進行形態觀察和生理生化測定鑒定。通過對所得菌株的生物學特性研究，可以初步得出菌株對環境的耐受性及在不同環境中的生長趨勢，可為以后在用耐鉛細菌或與其他方法聯合使用時提供理論依據，以實現高效、快速、低成本治理鉛污染。[JP]

1材料和方法

1.1材料

土樣，來自河北省棗強縣受重金屬污染的土壤。

1.2設備

超凈工作臺（SW-CJ-2FD，上海博迅實業有限公司）、振蕩培養箱（ZD-85，江蘇金壇市醫療器械廠）、恒溫生化培養箱（LRH-250，上海一恒科技有限公司）、顯微鏡（BME，徠卡顯微系統上海貿易有限公司）、數碼生物顯微鏡（N-800M，上海旦鼎國際貿易有限公司）、高壓滅菌鍋（MLS-3750，SANYO）。

1.3耐鉛細菌的分離

取0.1 g的土樣，接入Pb2+濃度0.01 mmol/L的牛肉膏蛋白胨液體培養基中，在37 ℃、140 r/min條件下進行富集培養。取稀釋100倍后的富集菌懸液100 μL涂布在Pb2+濃度為0.02 mmol/L的牛肉膏蛋白胨固體培養基中，每組重復3次，于37 ℃下進行培養，觀察菌落生長情況。挑取單菌落在Pb2+濃度分別為0.1、0.2、0.5、1.0、1.5 mmol/L的牛肉膏蛋白胨固體培養基上逐漸劃線分離，經過多次純化，得到單菌株。將篩選出的菌株接入2.0、2.5、3.0 mmol/L不同濃度的固體培養基中，觀察細菌生長狀況，并淘汰耐鉛能力差的菌株，篩選出耐鉛能力最強的菌株[4]。

1.4耐鉛細菌鑒定

1.4.1對單菌落的大小、形狀等進行觀察采用革蘭氏染色法對菌株進行染色并觀察。

1.4.2生理生化特征

主要包括檸檬酸鹽的利用，丙酸鹽的利用，氧化酶、接觸酶、酪氨酸水解、苯丙氨酸脫氫酶實驗，糖醇發酵、V.P產生、明膠、液化、需氧性測定等[5]。

1.4.3生物學特性試驗

1.4.3.1耐鉛細菌生長曲線的測定

將菌株活化18 h后接種到液體培養基，37 ℃、轉速140 r/min條件下振蕩培養。每2 h測定1次細菌菌懸浮液的D600 nm值。

1.4.3.2pH值對耐鉛細菌生長的影響

將菌株活化18 h后，分別接入pH值為4、6、7、8、9、10的液體培養基中，37 ℃、轉速140 r/min條件下振蕩培養24 h。測定不同pH條件下細菌懸浮液的D600 nm值。

1.4.3.3鹽度對耐鉛細菌生長的影響

將菌株活化18 h后接入0%、1%、2%、4%、5%、7%、10%鹽度的培養液，37 ℃、轉速140 r/min條件下振蕩培養24 h。測定不同鹽度條件下細菌懸浮液的D600 nm值。

1.4.3.4不同溫度對耐鉛細菌生長的影響

將菌株活化 18 h 后接種到液體培養基，在溫度分別為4、25、32、37、42、48、50、60 ℃，轉速140 r/min條件下振蕩培養24 h。測定在不同溫度下的細菌懸浮液的D600 nm值。

2結果與分析

2.1耐鉛細菌的分離

通過對樣品的分離純化，篩選出2株耐鉛能力強的耐鉛細菌。1株耐受鉛離子濃度最高為2.0 mmol/L，命名為ZQq1，另外1株耐受鉛離子最高濃度為2.5 mmol/L，命名為DYq2。

2.2耐鉛細菌的鑒定[HT]

2.2.1耐鉛細菌菌落特征耐鉛細菌菌落特征結果見表1。

2.2.2耐鉛細菌生理生化特征

細菌的生理生化特征是鑒定細菌種類的重要指標和依據，結果見表2。

根據表1中2株細菌的菌落形態特征和表2以及2株耐鉛細菌的革蘭氏染色情況，依據《伯杰氏細菌鑒定手冊》（第8版），將2株菌ZQq1和DYq2鑒定為芽孢桿菌屬。

2.3耐鉛細菌的生物學特性

2.3.1耐鉛細菌的生長曲線

從樣品中篩選出的2株耐鉛細菌ZQq1和DYq2的生長曲線見圖1。

由圖1可知，ZQq1在2 h內為生長延遲期，18 h附近達到穩定期，在約32 h D600 nm值開始下降，即過了穩定期；DYq2在 2 h 內為生長延遲期，在22 h附近達到穩定期，在約35 h開始進入衰亡期。

2.3.2pH值對耐鉛細菌生長的影響

菌株對pH值的適應

力，在一定程度上也表明了菌株對環境的適應能力。pH值對耐鉛細菌ZQq1和DYq2生長的影響見圖2。由圖2可知，ZQq1和DYq2均在弱堿性（pH值約為8）條件下生長最好。ZQq1在pH值為4～8的區間內，隨著pH的增大ZQq1生長逐漸變好，當pH值大于10時ZQq1無法生長。DYq2在pH值為4～8的區間內，隨著pH值的增大DYq2生長逐漸變好，當pH值小于4時會抑制DYq2菌的生長。

2.3.3鹽度對耐鉛細菌生長的影響

細菌對不同鹽度的適應性差異，可以反映出細菌對環境的適應能力。一般的培養基中也會添加少量鹽以維持滲透壓。由圖3可知鹽度對2株耐鉛細菌ZQq1和DYq2生長的影響。隨著鹽度的增加，ZQq1和DYq2生長受抑制程度也在增加。ZQq1最適生長鹽度為1%，DYq2最適生長鹽度為0。ZQq1耐鹽度極限7%，DYq2耐鹽度已達到接近于10%。

2.3.4溫度對耐鉛細菌生長的影響

不同的溫度下細菌的生長速率不同，從中也體現出了細菌對生長環境的一定適應能力。溫度對耐鉛細菌ZQq1和DYq2的生長影響見圖4。由圖4可知，隨著溫度的增加2株菌的生長速率均提高，約42 ℃為最適生長溫度，ZQq1在4～20 ℃區間范圍內，生長速率變化比較平緩，而在20～40 ℃區間變化較大，隨著溫度升高曲線變得平緩，之后陡然下降，在50 ℃時不能生長，而DYq2在4 ℃到最適合生長溫度之間變化趨勢相同，過了最適生長溫度下降明顯，在60 ℃時生長被抑制。[HT]

3結論

[JP2]從河北省棗強縣受重金屬污染的土壤中分離出2株耐鉛能力較強的耐鉛細菌，即ZQq1和DYq2。分別從以下進行描述：（1）ZQq1的菌落邊緣整齊，表面光滑，乳白色。菌體桿狀，產生芽孢，革蘭氏陽性，具有運動性，好氧生長，經鑒定為芽孢桿菌屬菌。其在pH值為弱堿性條件下生長最好，在pH值大于10時或小于4時不能生長，最適生長溫度在42 ℃附近，在50 ℃及以上不能生長，其菌株在鹽度為7%及以上完全抑制生長，耐受鉛離子濃度最高2 mmol/L。（2）DYq2的菌落邊緣整齊，表面光滑，乳白色。菌體桿狀，產生芽孢，革蘭氏陽性菌，具有運動性，好氧生長，菌體有成鏈趨勢，經鑒定為芽孢桿菌屬菌。DYq2在pH值為8時生長最好，其能在42 ℃條件下生長，在 60 ℃ 及以上不能生長，其菌株不耐鹽，在鹽度10%及以上完全抑制生長，耐受鉛離子濃度最高為 2.5 mmol/L。

參考文獻：

[1]李宏，江瀾. 土壤重金屬污染的微生物修復研究進展[J]. 貴州農業科學，2009，37（7）：72-74.

[2]高文謙，陳玉福. 鉛污染土壤修復技術研究進展及發展趨勢[J]. 有色金屬，2011，63（1）：131-136.

[3]駱永明. 污染土壤修復技術研究現狀與趨勢[J]. 化學進展，2009（2）：558-565.

[4]陳美標，郭建華，姚青，等. 大寶山礦區耐Cd2+細菌的分離鑒定及其生物學特性[J]. 微生物學通報，2012，39（12）：1720-1733.

[5]江春玉，盛下放，何琳燕，等. 1株鉛鎘抗性菌株WS34的生物學特性及其對植物修復鉛鎘污染土壤的強化作用[J]. 環境科學學報，2008，28（10）：1961-1968.