新疆棉花黃萎病菌生理型鑒定

陳民志 +張海萍++曲延英 +朱荷琴++葉武威++馬前程++劉莎++聶夢穎++顧愛星

摘要：通過分離、培養新疆南疆、北疆若干地點采集棉株中的黃萎病菌，對不同抗病性的棉花有效接種黃萎病菌，采用鑒別寄主法和特異性引物PCR檢測技術來確定棉花黃萎病菌的類型。得出菌株44-138在30個棉花品種上均表現強的致病力。

關鍵詞：棉花黃萎病；生理型；培養性狀；鑒定法

中圖分類號：S435.621.2+4文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2017）04-0070-03

棉花黃萎病菌（Verticillium dahliae Kleb.）是一種典型的土傳植物維管束病害，在世界各主要植棉區均有發生，并呈日益蔓延的趨勢，嚴重影響我國主產區新疆棉花的產量與安全[1]。姚耀文等研究表明，新疆和田及車排子菌，生理型2號，致病力最弱[2]。2000年前，新疆沒有落葉型黃萎病菌菌系的報道[3]。2004年，張莉等從南北疆各主要植棉區采樣進行檢測，發現在南北疆已存在落葉型菌系，但數量很少[4]。2004年，段維軍等采用營養親和群和分子生物學的方法，再次證實新疆存在落葉型黃萎病菌菌系[5]。根據2008—2009年對棉花枯萎病、黃萎病的調查，近年來，棉花黃萎病的發生日益嚴重，重病田明顯增多，急性枯死型癥狀不斷出現，給當地農業生產帶來極其嚴重的損失[6]，培育抗病品種是目前防治棉花黃萎病的有效措施，抗病育種需要明確棉花黃萎病菌的生理型、致病性分化和簡易、準確的鑒定方法。

本研究通過分離、培養新疆南疆、北疆若干地點采集棉株中的黃萎病菌，對不同抗病性的棉花有效接種黃萎病菌，鑒定棉花黃萎病抗病性，探明棉花黃萎病菌生理型的簡易、準確鑒定方法，為棉花抗病性研究提供依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1棉花品種

共30份抗病性不同的棉花品種（系）。抗病品種（系）：新海16號、新陸早26號、中棉所35號、中棉所12號、中棉所17號、愛字棉、軍海1號、新海20號、中棉所19號、新陸早12號；耐病品種（系）分別為新陸早48號、遼棉18號、新陸早11號、冀668、川737、新陸中42號、新陸早42號；感病品種（系）分別為新陸早1號、新陸早36號、大鈴棉、老炮臺、108夫、F2、碩豐1號、新陸早13號、蘇K202、新陸早35號、新陸早16號、新陸早50號。對照為感病品種軍棉1號。所有棉花品種（系）均來自新疆農業大學農學院植物育種系。

1.1.3供試棉花黃萎病菌

以落葉型棉花黃萎病菌株V76、V991為對照，對照菌株由美國南部平原棉花研究所及南京農業大學提供。

1.2方法

1.2.1分離棉花黃萎病菌的方法

挑出發病棉株，留莖下部，洗凈去皮，擦干，切成1～3 mm小塊，用于無菌操作；在超凈工作臺，將切好的病棉小塊材料先后置于2%的次氯酸鈉、75%乙醇和無菌水中各泡1～2 min，用無菌紙拭干，移入含0.01%鏈霉素的PDA培養基，置于25 ℃恒溫培養箱培養；待菌株長出，進行純化、鏡檢、培養性狀觀察；置于-4 ℃冰箱中待用。

1.2.2鑒別寄主法

1.2.2.1棉苗培育

挑選飽滿的棉種進行催芽處理，待種芽長度達到1 cm時播種[7]。將催芽后的棉花種子種植在裝有滅菌土的無底塑料缽中，每缽種植6粒種子，每個品種10缽，播種后將營養缽置于托盤內，托盤中灌滿清水，放置在人工氣候箱中培養，光照12 h，溫度27 ℃；黑暗12 h，溫度 22 ℃[8]。棉種出苗后，每個營養缽中留棉苗3株，待2張真葉展平時接菌[9]。

1.2.2.2接種黃萎病菌孢子液的制備

將分離培養的菌種在PDA平板上活化3 d后，用打孔器在菌落上打孔，挑取5～6塊菌絲塊放置液體PDA培養基中，于26 ℃下靜置培養3 d后，挑取液體培養基表面的菌絲。轉接到營養較少的液體PDA培養基中，放在20 r/min、26 ℃的搖床里培養，7 d后用4層紗布過濾，在顯微鏡下用血球計數板將孢子濃度調至 2×107個/mL，現配現用。本研究采用營養較少的PDA培養基配方為馬鈴薯50 g、蔗糖5 g、蒸餾水1 000 mL。

1.2.2.3棉苗接種

采用接種方法為切根蘸菌法，用滅菌后的剪刀在塑缽的底部將棉苗的須根剪掉，然后放在盛有 30 mL 孢子懸液的培養皿中泡10 min，然后放回托盤中。7月19日挑選飽滿的棉種，用30%的H2O2沖洗3次，最后1次浸泡5 h后，用無菌水沖洗2～3遍，最后用無菌水浸泡12 h，將土于高壓蒸汽鍋中滅菌；7月20日播種于直徑10 cm、高 10 cm 的有底塑料缽中，土下3～5 cm位置，7月27日長出2片真葉，每缽留3株，將棉花黃萎病菌孢子濃度調至 2×107個/mL，將棉株剪去底根放入其中泡10 min，然后放回托盤中，每2 d澆水1次、記錄1次，15 d后開始零星發病，9月10日調查。

1.2.2.4抗病性鑒定

當感病對照的病情指數達50左右時，按全國統一標準調查不同品種的發病情況。采用相對病情指數來劃分抗病類型。先用50.0除以本期感病對照實際病情指數，計算校正系數K值。為保證鑒定結果的準確性，要求K值范圍0.75～1.25。然后將供試品種實際病情指數乘以K值，即為相對病情指數（表2）

計算公式：

[JZ]發病率=病苗總數/調查總數苗×100%。

病情指數=ε（發病級值×該級病葉數）/（最高發病級值×調查總葉數）×100%。

[JZ]相對病情指數（In）=K×鑒定品種的實際病指[2]。

K值的計算：

[JZ]K=50.00/DI。

式中：K表示校正系數；50.00表示感病對照標準綜合評價病情指數；DI表示本次鑒定感病對照綜合評價病情指數。

接種后每隔2 d記錄1次感病情況，播種50 d后，將棉苗全部削莖檢查，根據病情，分級記載（表3）。

1.2.3PCR鑒別方法

1.2.3.1DNA的提取

各供試菌系在PDA平板上25 ℃培養15 d，采用天澤基因工程有限公司生產的柱式土壤DNA out試劑盒，按照說明書操作提取DNA，將其保存在-20 ℃冰箱中備用。

1.2.3.2引物合成

PCR特異性引物選用Pérez-Artés等設計的檢測棉花黃萎病菌落葉型（D1/D2）、非落葉型（ND1/ND2）的2對特異性引物[14]，擴增片段大小分別為 550、1 500 bp。

1.2.3.3PCR反應體系及擴增條件

PCR反應體系：10×buffer（含Mg2+）2.5 μL、200 μmol/L dNTP、0.5 umol/L各引物、1 U Taq DNA polymerase、模板1 μL，總體積25 μL。擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸 2 min，34個循環；72 ℃延伸10 min。

1.2.3.4PCR產物的電泳檢測

PCR產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結束后將瓊脂糖凝膠置于含有0.5 μg/mL EB的染液中染色15 min，然后置于凝膠成像儀上觀察并掃描于計算機軟件中保存。

1.2.3.5統計分析

采用Excel 2007對數據進行初步處理，然后利用SPSS 18.0軟件分析黃萎病相對病情指數與產量性狀指標間的相關關系。

2結果與分析

2.1分離得到的棉花黃萎病菌

定出棉花黃萎病的致病性，對病情的防治有著重要意義。關于棉花致病性常見的檢測方法有溫室致病性測定、菌落培養性狀比較和分子檢測等方法，棉花黃萎病菌生理型的鑒定主要通過接種病原菌后的鑒別寄主抗感反應型進行劃分[15]。本試驗通過鑒別寄主法得到棉株對菌株44-138的平均相對感病系數為41.4。郭景紅等對近5年新疆審定通過的新陸早系列棉花品種抗黃萎病進行鑒定，新審定棉花品種抗黃萎病性較弱，僅有28%的品種鑒定抗病，32%的品種鑒定感病[16]；邰紅忠對近幾年新疆南部棉區示范和試種棉花品種進行了黃萎病抗病性鑒定，耐病品種占黃萎病鑒定材料的2143%，沒有抗病材料[17]。本試驗通過鑒別寄主法得到30個棉花品種（系）對菌株44-138僅有20%的品種（系）鑒定耐病，80%品種（系）鑒定感病，與前人研究結果一致。2004年，張莉等從南疆、北疆主要植棉區采樣進行檢測，發現在南疆、北疆已存在落葉型菌系，但數量很少[4]。本試驗驗證了該結論?，F在南疆、北疆都存在落葉型菌系，具體分布、致病力、生理型都不明確，還有待進一步研究分析。

從南疆、阿克蘇16團采樣地點的感病棉株中分離出 N-2、AKS16菌株，分離率分別為40.0%、12.5%。北疆石河子122團、132團分離出了81-4、44-138菌株，分離率分別為50%、25%。從中選出44-138菌株進行鑒別寄主法鑒定，得出棉株平均相對感病系數為41.4，且每個棉株的相對感病系數都大于30.1，所以44-138菌株屬強致病力菌系，生理型屬生理I型。

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