百里香精油和多抗霉素對馬鈴薯立枯絲核菌病原菌的抑制作用研究

張阿強+田永強+劉震飛+潘彥彪

摘要：為了研究百里香精油和多抗霉素對馬鈴薯立枯絲核菌的抑制效果，采用菌絲生長速率抑制法，測試了百里香精油和多抗霉素對馬鈴薯立枯絲核菌菌絲的抑制效果，并研究了兩者的協同抑菌作用。結果表明：百里香精油和多抗霉素均可有效抑制馬鈴薯立枯絲核菌，兩者最小抑菌濃度MIC分別為0.6422微升/毫升、0.9393微升/毫升，且兩者表現出明顯的協同抑菌效果，為生物制劑的開發提供了依據。

關鍵詞：百里香精油；多抗霉素；協同作用；抗真菌活性；立枯絲核菌

中圖分類號： TS201.3 獻標識碼： A DOI編號： 10.14025/j.cnki.jlny.2017.08.030

傳統農藥在農業作物病蟲害預防與防治、保證農作物穩定高產方面發揮了重要作用。但是，隨著人們長期大量使用抗生素類農藥，病原菌產生抗藥性問題日益受到廣泛關注[1，2]。因而針對植物病害的植物源農藥的研究與開發成為當今農藥研究領域的一個熱點[3-5]。百里香精油作為其中一種高效的植物源抑菌藥物，受到廣大科研工作者的青睞。百里香精油已被證明具有廣譜的抑菌性能，可以有效抑制食品上的曲霉與李斯特菌，傷口上包括革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌在內的細菌[6-8]。

馬鈴薯立枯絲核菌病，又稱黑痣病、莖潰瘍病、莖基腐病、黑色粗皮病，是通過帶病種薯和土壤傳播的。隨著馬鈴薯產業的迅猛發展，該病的發病率逐年升高，目前已成為阻礙馬鈴薯產業健康發展的主要病害之一。該病害的病原菌為立枯絲核菌（Rhizoctonia solani），可以侵染不同器官，引起多種癥狀，嚴重影響產品的商品性和貯藏性[9-11]。

本文以馬鈴薯立枯絲核菌菌為供試菌株，測試了在體外條件下百里香精油及多抗霉素對馬鈴薯立枯絲核菌菌絲生長的抑制效果，并研究了百里香精油與多抗霉素的協同抑菌作用。

1 材料與方法

1.1材料儀器

供試菌株：馬鈴薯立枯絲核病菌（Rhizoctonia solani）菌種，由本實驗室保存。

試劑：無水乙醇、葡萄糖、Tween-80均為國產分析純，百里香精油購自江西華美香料。

儀器設備：電子天秤（YP102N 上海精科儀器）、超凈工作臺（SW-CJ-2D 蘇州凈化）、立式高壓蒸汽滅菌鍋（LDZX-50F 上海申安）、培養箱（MJ-250-I 上海一恒）、分析天平（FA1204B 上海精科儀器）。

1.2方法

1.2.1培養基與藥品準備 PDA培養基：200克土豆去皮、切塊煮爛后，紗布過濾，加入20克葡萄糖、16克瓊脂，1000毫升蒸餾水，pH值自然。

100倍百里香精油配制：以無水乙醇為溶劑，將百里香精油分別稀釋為10μL/mL、20μL/mL、30μL/mL，同時向其中添加20μL/mL的吐溫-80，經20μm膜過濾除菌后備用。

100倍多抗霉素配制：用蒸餾水將多抗霉素分別配制成10mg/mL、20 mg/mL、50 mg/mL、100 mg/mL的溶液，經20μm膜過濾除菌后備用。

1.2.2菌種活化 在無菌條件下，從保藏的斜面菌種中挑取馬鈴薯立枯絲核菌菌塊，接入PDA培養基平板上。28℃培養120小時，備用。

1.2.3百里香精油抑菌活力測定 經121℃高溫蒸汽滅菌20分鐘的PDA培養基，在超凈工作臺上冷卻至55℃左右時，按100毫升培養基添加1毫升100倍百里香精油的量，分別添加不同濃度的百里香精油。輕輕搖勻后倒入90毫米的培養皿中，制成含不同濃度百里香精油的平板。再用滅菌的5毫米打孔器在上述活化的馬鈴薯立枯絲核菌平板上打取菌餅，用鑷子將菌柄分別倒貼于含不同濃度百里香精油的平板上，對照組使用等體積的無水乙醇代替精油。置于培養箱28℃培養，并分別在72小時、96小時和120小時按十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.4多抗霉素抑菌活力測定 經121℃高溫蒸汽滅菌20分鐘的PDA培養基，在超凈工作臺上冷卻至55℃左右時，按100毫升培養基添加1毫升100多抗霉素的量，分別添加不同濃度的多抗霉素。輕輕搖勻后倒入90毫米的培養皿中，制成含不同多抗霉素的平板。用滅菌的5毫米打孔器在馬鈴薯立枯絲核菌平板上打取菌餅，然后用鑷子將菌餅分別倒貼于含不同濃度多抗霉素的平板上，對照組使用等體積的無菌水代替多抗霉素。置于培養箱28℃培養，并分別在72小時、96小時和120小時按十字交叉法測量菌落直徑[12]。

1.2.5百里香精油與多抗霉素協同作用測定 經121℃高溫蒸汽滅菌20分鐘的PDA培養基，在超凈工作臺上冷卻至55℃左右時，按100毫升培養基添加1毫升濃度為20 mg/mL的多抗霉素。然后再分別加入1毫升濃度為10μL/mL、20μL/mL、30μL/mL的百里香精油。輕輕搖勻后倒入90毫米的培養皿中，制成含0.2mg/mL多抗霉素的平板及不同濃度的百里香精油的平板。用滅菌的5毫米打孔器在馬鈴薯立枯絲核菌平板上打取菌餅，然后用鑷子將菌餅分別倒貼于平板上，對照組用等體積的無菌水和無水乙醇代替多抗霉素和百里香精油。置于培養箱28℃培養，并分別在72小時、96時小時和120小時按十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.6數據分析 菌絲生長抑菌率按如下公式計算：

菌落增長直徑=菌落直徑-接種菌餅直徑

測量結果利用origin8.5軟件繪制標準曲線，求出毒力方程、相關系數、MIC、EC50[12]。

2結果與分析

2.1百里香精油對馬鈴薯立枯絲核病原菌菌絲生長的抑制活性

由圖1可以看出，百里香精油隨著濃度的增大其抑菌效果逐漸增加，在濃度為0.4 μL/mL時，抑菌率達到100%。在百里香精油濃度大于0.2 μL/mL時，對馬鈴薯立枯絲核病原菌有顯著的抑制作用。在濃度為0.1 μL/mL至0.3 μL/mL時，抑菌效果由快變緩，在濃度大于0.3 μL/mL時，抑菌效果由緩變快。抑菌效果隨著時間呈延長下降趨勢，在百里香精油的濃度為0.4 μL/mL時，三個時間點的抑菌濃度為100%，無變化。利用試驗數據進行統計分析，在72小時的毒力方程為：Y=1.2775x+0.1796，r=0.9649，得出百里香精油對馬鈴薯立枯絲核病原菌的EC50為0.2509 μL/mL，MIC為0.6422 μL/mL。

2.2多抗霉素對馬鈴薯立枯絲核病原菌菌絲生長的抑制活性

由圖2可以看出，在濃度為1.0 mg/mL時，抑菌率達到最大值，為100%。在濃度大于0.5 mg/mL時抑菌效果由快變緩。抑菌效果隨著時間的延長呈明顯的下降趨勢，在百里香精油的濃度為1.0 mg/mL時，三個時間檢測點的抑菌濃度接近100%，沒有明顯的變化。利用試驗數據進行統計分析，在72小時時的曲線毒力方程為Y=0.9177x+0.1380，r=0.9416，計算結果表明多抗霉素對馬鈴薯立枯絲核病原菌的EC50為0.3944 mg/mL，MIC為0.9393 mg/mL。

2.3百里香精油和多抗霉素對馬鈴薯立枯絲核病原菌菌絲生長的協同抑制活性

馬鈴薯立枯絲核在百里香精油濃度為0.05 μL/mL時培養觀察120小時的抑菌率為20.76%，多抗霉素濃度為0.1 mg/mL時，培養120小時時的抑菌率為7.27%，兩者的抑菌率均小于10%，但是百里香精油和多抗霉素在此濃度下的協同抑菌效果到了93.22%，表現出顯著的協同抑菌效果。

3結論

本試驗表明，在體外條件下百里香精油可以有效地抑制馬鈴薯立枯絲核菌病原菌菌絲的生長，在較低濃度下（0.4μL/mL）即可完全抑制其菌絲的生長。研究顯示，百里香精油還擁有廣譜的抑菌作用，因此百里香精油具有開發為高效抑菌的植物源農藥的潛力。試驗還表明，百里香精油與抗真菌類抗生素多抗霉素之間具有協同作用，二者配合使用可以顯著地提高抑菌效率，降低藥物使用量，為生物農藥的開發提供依據。

另外，從試驗中可以看出，百里香精油的抑菌效果隨時間的推移而下降，這與精油易揮發的性質有關。所以，要想高效利用百里香精油作為抑菌農藥，還需探索其使用方式，以避免其揮發浪費。

參考文獻

[1]劉源.農用抗生素高效發現新技術及系列新產品產業化[J].中國畜牧業，2016，（04）：20-20.

[2]孫建析，朱勇，陳瓊姜，等.生物農藥的安全性評價[J].浙江省醫學科學院學報，2005，（03）：34-36.

[3]劉芳，龔明福，吳三林，等.天南星科植物乙醇浸提液對植物病原菌抑菌活性分析[J].基因組學與應用生物學，2016，35（01）：152-157.

[4]汪靜，進華，新春，等.6種植物提取物對荔枝霜疫霉的抑制作用[J].基因組學與應用生物學， 2016，35（5）：1219-1223.

[5]楊勇，王建華，吉沐祥，等.植物源農藥丁子香酚與苦參堿及其混配對葡萄灰霉病的毒力測定及田間防效[J].江蘇農業科學，2016，44（12）：160-163.

[6]Matěj Bo ik， Miroslava Císarová， Dana Tan inová， et al. Selected essential oil vapours inhibit growth of Aspergillus，spp.in oats with improved consumer acceptability[J]. Industrial Crops＼s&＼sproducts， 2016.

[7]Gouveia A R， Alves M， Silva J A， et al. The Antimicrobial Effect of Rosemary and Thyme Essential Oils Against Listeria Monocytogenes， in Sous Vide， Cook-chill Beef During Storage ☆[J]. Procedia Food Science， 2016，（07）：173-176.

[8]Sienkiewicz M， ysakowska M， Kowalczyk E， et al. The ability of selected plant essential oils to enhance the action of recommended antibiotics against pathogenic wound bacteria[J]. Burns， 2017，（43）：310-317.

[9]曹春梅，李文剛，張建平，等.馬鈴薯黑痣病的研究現狀[J].中國馬鈴薯，2009，23（03）：171-173.

[10]劉振鑄，秦曉東，姜麗艷.馬鈴薯黑痣病防治方案[J].吉林農業，2015，（01）：63-64.

[11]拓寧.立枯絲核菌對馬鈴薯的侵染過程及致病機理研究[D].甘肅農業大學，2015.

[12]周金偉，周紅麗，易有金，等.短芽胞桿菌對植物病原真菌的抑菌活性和抑菌機理[J].植物保護學報，2016，43（4）：600-

607.

作者簡介：張阿強，在讀碩士研究生，研究方向：資源與環境微生物。