左卡尼汀對(duì)大鼠肝臟熱缺血及再灌注損傷的保護(hù)作用

李文川+高良奎+李浩航+韋秋業(yè)+楊潔+汪建初+浦澗

【摘要】目的研究左卡尼汀對(duì)大鼠肝臟熱缺血及再灌注損傷的保護(hù)作用，并探討其相關(guān)機(jī)制。方法將48只雄性SD大鼠隨機(jī)分為三組：假手術(shù)（SO）組，肝熱缺血及再灌注（WIR）組，左卡尼汀預(yù)處理（LC）組，各組內(nèi)再分為再灌注6 h、12 h亞組。LC組腹腔注射左卡尼汀，SO組及WIR組注射等量生理鹽水。檢測(cè)各組血清ALT和AST水平，測(cè)定肝組織超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）含量，觀察肝組織病理學(xué)改變。結(jié)果與SO組比較，WIR組6 h、12 h亞組血清ALT、AST水平均明顯高于SO組相同時(shí)間點(diǎn)亞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與WIR組比較，LC組6 h、12 h亞組血清ALT、AST明顯低于WIR組相同時(shí)間點(diǎn)亞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與SO組比較，WIR組6 h、12 h亞組肝組織勻漿SOD活性均明顯低于SO組相同時(shí)間點(diǎn)亞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；WIR組6 h、12 h亞組肝組織勻漿MDA含量均明顯高于SO組相同時(shí)間點(diǎn)亞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與WIR組比較，LC組6 h、12 h亞組肝組織勻漿SOD活性均明顯高于WIR組相同時(shí)間點(diǎn)亞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），LC組6 h、12 h亞組肝組織勻漿MDA含量均明顯低于WIR組相同時(shí)間點(diǎn)亞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論左卡尼汀對(duì)大鼠肝臟熱缺血及再灌注損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制與提高抗氧化防御系統(tǒng)和脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】左卡尼汀；肝熱缺血及再灌注損傷；保護(hù)作用

中圖分類(lèi)號(hào)：R657.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2016.05.004

【Abstract】ObjectiveTo investigate the protective effects of LCarnitine on liver warm ischemia and reperfusion injury （WIRI） in rats，and to explore its possible mechanism.MethodsFortyeight male SpragueDawley（SD） rats were randomly divided into the following three groups：Shamoperated（SO）group，liver warm ischemia and reperfusion（WIR） group and LCarnitine pretreatment（LC）group.Within each group，rats were divided into reperfusion 6h and 12h subgroups.LCarnitine was injected through abdominal cavity in LC group while the equal volume of saline was injected in SO group and WIR group.And then，the levels of serum Alanine aminotransferase（ALT） and Aspartate aminotransferase（AST） as well as the activities of Superoxide dismutase（SOD） and the content of Malondialdehyde（MDA） in liver tissues were detected.Meanwhile，pathological change of liver tissue was observed.ResultsCompared with the SO group，serum ALT and AST levels of 6h and 12h subgroups in the WIR group at the same time point were significantly higher，difference was statistically significant（P<0.01）；Compared with the WIR group，serum ALT and AST levels of 6h and 12h subgroups in the LC group at the same time point were significantly lower，difference was statistically significant（P<0.01）.Compared with the SO group，SOD activities of liver homogenate of 6h and 12h subgroups in the WIR group at the same time point were obviously lower，difference was statistically significant（P<0.01），while the content of MDA was significantly higher，difference was statistically significant（P<0.01）.In addition，SOD activities of liver homogenate of 6h and 12h subgroups in the LC group at the same time point were obviously higher than those of the WIR group，difference was statistically significant（P<0.01），while the content of MDA was significantly lower，difference was statistically significant（P<0.01）.ConclusionLCarnitine has protective effects on WIRI in rats，its mechanism may be related with improvement of the antioxidant defense system and lipid peroxidation levels.

【Key words】LCarnitine；WIRI；protective effects

肝臟熱缺血及再灌注損傷（warm ischemia and reperfusion injury，WIRI）是肝臟手術(shù)中多因素且復(fù)雜的病理生理過(guò)程，其顯著影響疾病的預(yù)后、手術(shù)成功率及患者的生存[1]。左卡尼汀（Lcarnitine，LC）在平衡抗氧化系統(tǒng)過(guò)程中扮演著重要角色，并具有抗過(guò)氧化的效果[2]。近年研究報(bào)道左卡尼汀在腎缺血再灌注損傷中具有明顯保護(hù)作用[3]，但其在肝臟WIRI中的作用研究較少。本研究建立大鼠肝臟熱缺血及再灌注損傷模型，觀察肝功能、肝組織病理學(xué)改變及超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）的變化，探討左卡尼汀對(duì)大鼠肝臟WIRI的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1材料與方法1.1材料與試劑SPF級(jí)雄性SpragueDawley（SD）大鼠48只，體重240～270 g，由右江民族醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心（許可證號(hào)：SCXK桂2012-0003）提供；左卡尼汀注射液購(gòu)自常州蘭陵制藥有限公司；組織總超氧化物歧化酶（TSOD）、MDA測(cè)試盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；石蠟切片機(jī)（德國(guó)HM 315）；紫外分光光度計(jì)（中國(guó) UV1750）；全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)貝克曼Beckman LX20）。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組及給藥大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為三組，每組16只，分別為假手術(shù)（Shamoperated，SO）組、肝熱缺血及再灌注（WIR）組、左卡尼汀預(yù)處理（LC）組，每組按肝門(mén)血管復(fù)流時(shí)間不同分為6 h、12 h兩個(gè)亞組（各亞組n=8）。LC組術(shù)前30 min每只大鼠予腹腔注射LC 200 mg/kg，SO組、WIR組術(shù)前30 min每只大鼠予腹腔注射等量生理鹽水。

1.2.2模型的建立大鼠術(shù)前禁食 6～8 h，但可適量禁水。稱重后采用10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉。SO組僅常規(guī)進(jìn)腹后，游離但不予結(jié)扎肝十二指腸韌帶內(nèi)血管。LC組、WIR組建立大鼠肝臟WIRI模型，于劍突下取腹正中切口長(zhǎng)約2.5 cm，打開(kāi)腹腔后將腸管推向左側(cè)于腹腔外，并用生理鹽水紗布覆蓋，離斷鐮狀韌帶及左右三角韌帶，分離肝胃韌帶，充分暴露肝門(mén)部及肝十二指腸韌帶后，游離門(mén)靜脈及肝固有動(dòng)脈；3 min后用微血管夾將門(mén)靜脈和肝固有動(dòng)脈阻斷30 min，造成原位肝熱缺血模型；阻斷30 min后小心松開(kāi)微血管夾進(jìn)行再灌注復(fù)流，常規(guī)關(guān)腹，造成原位肝熱缺血及再灌注模型；再灌注 6 h、12 h后，穿刺腹主動(dòng)脈遠(yuǎn)端采血并獲取肝組織標(biāo)本。

1.2.3大鼠血清ALT、AST指標(biāo)檢測(cè)大鼠血液靜置后高速離心（3000 rpm）15 min，留取血清，分裝存放于-80℃冰箱保存。將凍存血清解凍混勾后用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氧酶（AST）水平。

1.2.4肝組織病理檢查部分肝組織置于10%甲醛溶液中固定24 h后，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋后，制成4 μm連續(xù)切片，行HE染色。用光學(xué)顯微鏡觀察肝組織病理改變。

1.2.5肝組織勻漿SOD活性和MDA含量的檢測(cè)取適量肝組織制備肝組織勻漿液，離心、提取上清液，通過(guò)考馬斯亮藍(lán)法蛋白定量測(cè)試盒測(cè)定蛋白濃度，采用SOD、MDA測(cè)試盒測(cè)定其活性。嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)采用（±s）表示，各組之間采用單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行比較，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2結(jié)果2.1大鼠肝組織病理學(xué)變化HE染色鏡下觀察：SO組6 h亞組肝小葉結(jié)構(gòu)大致正常，無(wú)肝細(xì)胞變性壞死，再生肝細(xì)胞少（圖1A）；WIR組6 h亞組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，肝小葉細(xì)胞大量水腫，可見(jiàn)肝細(xì)胞水變性、脂肪變性及大量壞死，小葉中央靜脈淤血、擴(kuò)張（圖1B）；而LC組6 h亞組肝組織損傷較輕，小葉中央靜脈輕度擴(kuò)張，肝小葉內(nèi)見(jiàn)肝細(xì)胞再生修復(fù)（圖1C）。SO組12 h亞組肝索、肝竇無(wú)明顯壞死、水腫，無(wú)肝細(xì)胞變性壞死，再生肝細(xì)胞少（圖1D）；WIR組12 h亞組肝小葉細(xì)胞可見(jiàn)輕度水腫，肝細(xì)胞水變性及細(xì)胞再生、修復(fù)（圖1E）；而LC組12 h亞組肝小葉細(xì)胞少量水腫，少量炎癥細(xì)胞，少量肝細(xì)胞再生修復(fù)（圖1F）。A：SO組6 h亞組；B：WIR組6 h亞組；C：LC組6 h亞組；D：SO組12 h亞組；E：WIR組12 h亞組；F：LC組12 h亞組。

2.2大鼠肝臟熱缺血再灌注后肝功能變化各組大鼠血清ALT、AST水平比較：與SO組比較，WIR組6 h、12 h亞組血清ALT、AST水平均明顯高于SO組相同時(shí)間點(diǎn)亞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；LC組6 h、12 h亞組血清ALT、AST稍高于S0組相同時(shí)間點(diǎn)亞組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與WIR組比較，LC組6 h、12 h亞組血清ALT、AST明顯低于WIR組相同時(shí)間點(diǎn)亞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見(jiàn)表1。

2.3肝組織勻漿SOD活性和MDA含量的檢測(cè)結(jié)果各組大鼠肝組織SOD活性和MDA含量比較：與SO組比較，WIR組6 h、12 h亞組肝組織勻漿SOD活性水平均明顯低于SO組相同時(shí)間點(diǎn)亞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；而WIR組6 h、12 h亞組肝組織勻漿MDA含量水平均明顯高于SO組相同時(shí)間點(diǎn)亞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；LC組6 h、12 h亞組肝組織勻漿SOD活性水平均明顯高于SO組相同時(shí)間點(diǎn)亞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；而LC組6 h、12 h亞組肝組織勻漿MDA含量水平與SO組相同時(shí)間點(diǎn)亞組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與WIR組比較，LC組6 h、12 h亞組肝組織勻漿SOD活性水平均明顯高于WIR組相同時(shí)間點(diǎn)亞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；同樣，LC組6 h、12 h亞組肝組織勻漿MDA含量水平均明顯低于WIR組相同時(shí)間點(diǎn)亞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見(jiàn)表1。

3討論左卡尼汀是機(jī)體合成類(lèi)似維生素的膳食化合物，它在脂質(zhì)代謝中起著重要的作用，能活化細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)鏈脂肪酸的攝取進(jìn)入線粒體基質(zhì)并進(jìn)行β氧化供能。左卡尼汀也作為一種抗氧化劑，通過(guò)清除羥基自由基和抑制羥基自由基的形成而免受活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的作用[4]。此外，其還可抑制脂質(zhì)過(guò)氧化和對(duì)抗氧化應(yīng)激，從而起到抗氧化活性作用[5]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，WIR組6 h、12 h亞組血清ALT、AST水平顯著升高，有肝功能障礙，肝組織病理學(xué)發(fā)現(xiàn)有明顯的形態(tài)改變，提示大鼠肝臟WIRI模型誘導(dǎo)成功；與WIR組6 h、12 h亞組相比較，LC組6 h、12 h亞組血清ALT、AST水平顯著降低，肝組織病理學(xué)形態(tài)損傷明顯減輕，提示左卡尼汀對(duì)大鼠肝臟WIRI具有保護(hù)作用，可改善肝功能，減輕肝組織損傷。

氧化應(yīng)激是肝臟WIRI發(fā)病機(jī)制的一個(gè)重要途徑[6]。再灌注早期階段，ROS是由黃嘌呤氧化酶氧化釋放大量電子，被O2接受后形成的[7]，ROS過(guò)剩最終導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。肝臟WIRI發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)可觀察到自由基形成和脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)生中間產(chǎn)物，如MDA升高[8]。此外，再灌注過(guò)程中過(guò)量的ROS可下調(diào)某些內(nèi)源性抗氧化劑表達(dá)酶如SOD[9]。在內(nèi)源性抗氧化防御機(jī)制中，SOD能催化超氧化物陰離子轉(zhuǎn)化為H2O2，再由過(guò)氧化氫酶轉(zhuǎn)化為H2O和O2，保護(hù)機(jī)體免受超氧陰離子的影響。這些內(nèi)源性抗氧化酶活性的提高在一定程度上起著對(duì)抗氧化應(yīng)激的保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，WIR組6 h、12 h亞組肝組織SOD活性較SO組6 h、12 h亞組顯著下降，而MDA含量顯著升高，表明肝臟WIRI后ROS大量生成，ROS聚集可能影響機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)，使肝細(xì)胞膜改變，肝組織發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，肝組織病理學(xué)改變，導(dǎo)致肝功能受損。而LC組6 h、12 h亞組肝組織SOD活性較WIR組6 h、12 h亞組顯著升高，而肝組織MDA含量顯著降低，提示左卡尼汀可通過(guò)增強(qiáng)抗氧化能力，清除ROS，減弱脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，減輕氧化應(yīng)激損傷，從而起到保護(hù)肝功能和肝組織的作用。

總之，左卡尼汀對(duì)大鼠肝臟WIRI的氧化應(yīng)激損傷可以通過(guò)提高抗氧化防御系統(tǒng)和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)而起到保護(hù)作用。但左卡尼汀對(duì)肝臟的保護(hù)作用可能是多方面的，其作用機(jī)制值得進(jìn)一步探討。參考文獻(xiàn)[1]Yang J， Sun H，Takacs P，et al.The Effect of Octreotide on Hepatic IschemiaReperfusion Injury in a Rabbit Model[J].Transplantation Proceedings，2013，45（6）：24332438.

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（收稿日期：2016-07-29修回日期：2016-10-23）