鴨肝炎病毒多克隆抗體的制備與鑒定

高蕾蕾+張巫凡+張聰+相朝鋒+王臣

摘 要：本試驗旨在建立鴨肝炎病毒多克隆抗體。通過鴨肝炎病毒（DHV-I）在雞胚尿囊腔中增殖，收集尿囊液作為免疫原，并制定免疫程序，動物免疫后獲得兔抗鴨肝炎病毒多克隆抗體；同時通過酶聯免疫吸附試驗測定多克隆抗體水平，硫酸銨鹽析法提純兔抗鴨肝炎病毒多克隆抗體。在研究中獲得了較高純度的兔抗鴨肝炎病毒多克隆抗體，為進一步建立鴨病毒性肝炎的診斷與檢測技術奠定實驗基礎。

關鍵詞：鴨肝炎病毒；多克隆抗體；酶聯免疫法；硫酸銨鹽析法

鴨病毒性肝炎（DVH）是由鴨肝炎病毒（DHV-I）引起的雛鴨的一種高度致死性傳染病，以發病急、傳播快、病程短、死亡率高為主要特征。臨床表現痙攣、抽搐和角弓反張等神經癥狀，以肝腫脹和出血為特征性病變。多克隆抗體是由多種抗原決定簇刺激機體產生各種各樣的單克隆抗體混雜而成。它具有識別多個抗原表位、抗原與抗體特異性結合、制備時間短、成本低等優點，廣泛應用于研究和診斷方面。本研究目的為制備鴨肝炎病毒多克隆抗體，為進一步建立鴨病毒性肝炎的診斷與檢測技術奠定實驗基礎。

一、材料與方法

1.試驗材料

鴨肝炎病毒XZ株由河南科技大學預防獸醫實驗室分離保存；2 kg 成年兔兩只購于孫旗屯；10日齡雞胚11枚購于洛陽現代禽業有限公司。

2.鴨肝炎病毒雞胚尿囊腔增殖

將鴨肝炎病毒注射到10日齡雞胚尿囊腔，收集24-72 h雞胚的澄清尿囊液，同時測定雞胚尿囊液的雞胚半數感染量。

3.動物免疫程序及兔抗鴨肝炎病毒多抗血清的收集

兩只成年兔分為兩組，一只實驗組，一只對照組；抗原注射以前收集5 mL正常血清，已備檢測抗體時作為陰性對照。多點注射鴨肝炎病毒雞胚尿囊增殖液1 mL；對照組正常飼養。一免一周后，采集實驗兔血液1 mL，放入28℃培養箱1 h后，再放入 4℃冰箱24 h，臺式離心機7000 r/min離心5 min，分離出血清，4 ℃保存備用。一免二周后，采集實驗兔血液1 mL，分離出血清，4 ℃保存備用；同時進行加強免疫，1 mL尿囊液背部多點注射。二免一周后，采集實驗兔血液1 mL，分離出血清，4 ℃保存。同時進行三免，1 mL尿囊液背部多點注射。三免一周后，進行心臟采血40 mL，分離出待檢血清，4 ℃保存。

4.間接ELISA法檢測兔抗鴨肝炎病毒多克隆抗體

分別于鴨肝炎病毒雞胚尿囊液首免實驗兔后0 d、7 d、14 d、21 d、28 d采集血液，分離得到的血清采用間接ELISA法檢測兔抗鴨肝炎病毒血清多克隆抗體OD450值。

5.硫酸銨鹽析法提純兔抗鴨肝炎病毒多克隆抗體

采用硫酸銨鹽析法粗提純兔抗鴨肝炎病毒多克隆抗體。在紫外分光光度儀上測定多克隆抗體溶液的OD280和OD260值。

按公式計算：蛋白質濃度（mg/mL）=（1.45×OD280-0.74×OD260）×稀釋度。

二、結果與分析

1.鴨肝炎病毒雞胚增殖情況分析

鴨肝炎病毒接種10齡雞胚后，棄去24 h內死亡的雞胚，收集24-72 h雞胚澄清的尿囊液。測定鴨肝炎病毒雞胚尿囊增殖液的雞胚半數感染量，檢測結果為：2.5×106/mL。

2.兔血清中抗鴨肝炎病毒多克隆抗體的動態變化

采用鴨肝炎病毒雞胚尿囊腔增殖液作為免疫原免疫成年兔，免疫兔后0 d、7 d、14 d、21 d、28 d采血并分離血清，通過間接ELISA法檢測兔血清中兔抗鴨肝炎病毒多克隆抗體的OD450值。間接ELISA法檢測結果如圖1顯示，血清中兔抗鴨肝炎病毒多克隆抗體OD450呈上升趨勢。

3.血清中兔抗鴨肝炎病毒多克隆抗體含量

采用硫酸銨鹽析法提純第28 d兔血清。紫外分光光度計測定多克隆抗體吸光度。根據公式計算多克隆抗體濃度為10.153 mg/mL。

三、討論

鴨病毒性肝炎最先發現于美國，其后，在英國、法國、德國、意大利、加拿大、印度等國陸續地報道有本病發生。1963年我國首次報道了上海某鴨場于1958年秋至1962年春暴發本病的情況。此后，全國各地都相繼報道了本病的爆發與流行。1980年至今，在我國多個地區已多次爆發該病，流行區域廣，且發病嚴重，卻沒有被很好地控制，仍然在主要的養鴨地區間歇發生，給我國的養鴨業帶來了巨大的損失。雞胚尿囊腔增殖鴨肝炎病毒，獲得了病毒增殖液，測得雞胚半數感染量為2.5×106/mL；間接ELISA實驗結果表明，血清中兔抗鴨肝炎病毒多克隆抗體水平逐漸升高；硫酸銨鹽析法提純兔抗鴨肝炎病毒多克隆抗體，紫外分光光度計檢測血清中兔抗鴨肝炎病毒多克隆抗體濃度為10.153 mg/mL，通過鴨肝炎病毒在雞胚尿囊腔中增殖，收集的尿囊液作為免疫原，免疫家兔后獲得了兔抗鴨肝炎病毒多克隆抗體，為進一步建立鴨病毒性肝炎的診斷與檢測技術奠定實驗基礎。

參考文獻：

[1] Saif Y M， Bames H J， Fadly A M. Diseases of Poultry （1lth Edition） [M]. America： Iowa State Press.2003：339-351.

[2] 范偉興，袁秀芳.1株鴨病毒性肝炎病毒的分離與鑒定[J].中國獸醫雜志，2000，26：17-18.

作者簡介：高蕾蕾（1994- ），女，河南濮陽人，本科學歷。

王臣（1979- ），男，安徽六安人，博士學歷，副教授，研究方向：動物分子病原學與免疫學。