PI3K/AKT/FoxO信號通路在胰島素類似生長因子1調節神經細胞PRNP基因表達中的作用

蔣國紅，王長明，張麗(遵義醫學院附屬醫院，貴州遵義563003)

PI3K/AKT/FoxO信號通路在胰島素類似生長因子1調節神經細胞PRNP基因表達中的作用

蔣國紅，王長明，張麗
(遵義醫學院附屬醫院，貴州遵義563003)

目的 探討磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/叉頭狀轉錄因子O亞家族蛋白( FoxO)信號通路在胰島素類似生長因子1(IGF-1)調節神經細胞PC12細胞株PRNP基因表達中發揮的作用。方法 將對數生長期的PC12細胞分為IGF-1組、實驗1組和實驗2組和對照組。IGF-1組加入終濃度80 ng/mL的IGF-1；實驗1、2組先加入25、50 μmol/L的PI3K /AKT/FoxO信號通路抑制劑LY294002， 37 ℃培養30 min后再滴入80 ng/mL的 IGF-1。對照組不加藥物。繼續培養24 h。采用實時熒光定量PCR法測算各組PC12細胞PRNP mRNA相對表達量，采用Western blotting法測算各組PC12細胞AKT、磷酸化AKT(pAKT)、FoxO3a和磷酸化FoxO3a(pFoxO3a)蛋白相對表達量。結果 IGF-1組PC12細胞PRNP mRNA及pAKT、pFoxO3a蛋白相對表達量高于對照組(P均<0.05)。實驗1、2組PC12細胞PRNP mRNA及pAKT、pFoxO3a蛋白相對表達量低于IGF-1組(P均<0.05)，且實驗2組低于實驗1組(P均<0.05)。結論 IGF-1通過磷酸化PI3K /AKT/FoxO信號通路蛋白AKT、FoxO3a調節PC12細胞PRNP基因表達。

磷脂酰肌醇3激酶；蛋白激酶B；叉頭狀轉錄因子O亞家族蛋白；胰島素樣生長因子1；PRNP基因

研究發現朊蛋白在β淀粉樣多肽誘發阿爾茨海默病(AD)的過程中有著重要的調控作用[1]。朊蛋白由管家基因PRNP編碼[2]。叉頭狀轉錄因子O亞家族蛋白( FoxO)是哺乳動物體內高度保守的轉錄調控蛋白，是磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號通路的下游蛋白。PI3K/AKT/FoxO信號通路參與調控神經細胞增殖、凋亡等多種生理過程[3]。本課題組前期研究發現，胰島素類似生長因子(IGF-1)能夠調控神經細胞PC12細胞株PRNP基因的表達，但這種調控作用是否通過PI3K/AKT/FoxO信號通路尚不明確。為明確PI3K/AKT/FoxO信號通路在IGF-1調節PC12細胞PRNP基因表達中的作用，筆者先在體外培養的PC12細胞中加入不同濃度的PI3K/AKT/FoxO信號通路抑制劑LY294002，然后再加入IGF-1繼續培養，比較PC12細胞PRNP基因表達情況。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞及主要試劑 PC12細胞購自中山大學實驗中心細胞庫。胎牛血清購于Hyclone公司；IGF-1購于Sigma公司；TRIzol購于Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒購于Fermentas公司；PI3K抑制劑LY294002購自碧云天公司；FoxO3a、磷酸化FoxO3a蛋白(pFoxO3a)、AKT、磷酸化pAKT、GAPDH抗體購于Santa Cruz公司；小量質粒抽提試劑盒、PVDF膜購于Promega公司。

1.2 細胞分組及IGF-1、 LY294002用法 將PC12細胞培養于含10%滅活胎牛血清、100 μg/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養基中，在37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養箱內培養，每24 h更換培養液，約2 d傳代一次，每次取生長狀態良好，細胞長滿培養瓶壁80%后，用胰酶消化后傳代。取對數生長期細胞，分為IGF-1組、實驗1組和實驗2組和對照組。IGF-1組加入終濃度80 ng/mL的IGF-1；實驗1、2組先加入25、50 μmol/L的LY294002， 37 ℃培養30 min后再滴入80 ng/mL的 IGF-1。對照組組不加藥物。繼續培養24 h。每組設3個平行孔。

1.3 各組PC12細胞PRNP mRNA相對表達量測算方法 收集各組細胞，用裂解液裂解，置于4 ℃下12 000 r/min離心5 min，轉移并分裝上清液，存于-80 ℃冰箱備用。采用實時熒光定量PCR法檢測各組PC12細胞PRNP mRNA。PRNP上游引物：5′-GGAGAACTTCACGGAGACCG-3′，下游引物：5′-CTCCCGTCGTAATAGGCCTG-3′；GAPDH上游引物：5′-AGGGCTGCCTTCTCTTGTGA-3′，下游引物：5′-AACTTGCCGTGGGTAGAGTCA-3′。以GAPDH為內參照。以2-ΔΔCt表示PRNP mRNA相對表達量。

1.4 各組PC12細胞AKT、磷酸化AKT(pAKT)、FoxO3a、磷酸化FoxO3a(pFoxO3a)相對表達量測算方法 采用Western blotting法。從各組細胞裂解液中提取總蛋白，用SDS-PAGE膠進行電泳分離，然后將其轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加AKT/pAKT、FoxO3a/pFoxO3a、GAPDH一抗，4 ℃過夜，TBST洗膜3次，二抗室溫孵育2 h，洗膜、化學發光、顯影、掃描，成像。AKT、pAKT、FoxO3a、pFoxO3a條帶和內參照GAPDH條帶灰度值的比值為各組AKT、pAKT、FoxO3a、pFoxO3a相對表達量。

2 結果

2.1 各組PC12細胞PRNP mRNA相對表達量比較 對照組、IGF-1組、實驗1組、實驗2組PC12細胞PRNP mRNA相對表達量分別為1.00±0.06、3.03±0.26、2.06±0.16、1.34±0.36。IGF-1組PC12細胞PRNP mRNA相對表達量高于對照組，P<0.05。實驗1、2組PC12細胞PRNP mRNA相對表達量低于IGF-1組，且實驗2組低于實驗1組，P均<0.05。

2.2 各組PC12細胞AKT、pAKT、FoxO3a、pFoxO3a蛋白相對表達量比較 各組PC12細胞AKT、pAKT、FoxO3a、pFoxO3a蛋白相對表達量見表1。由表1可見，各組PC12細胞AKT、FoxO3a相對表達量相比，P均>0.05。IGF-1組PC12細胞pAKT、pFoxO3a相對表達量均高于對照組，P均<0.05。實驗1、2組PC12細胞pAKT、pFoxO3a相對表達量均低于IGF-1組，且實驗2組低于實驗1組，P均<0.05。

表1 各組PC12細胞AKT、pAKT、FoxO3a、pFoxO3a蛋白相對表達量比較±s)

注：與對照組相比，*P<0.05；與IGF-1組相比，#P<0.05；與實驗1組相比，ΔP<0.05。

3 討論

已有研究顯示，AD特征性病理改變與腦部胰島素、IGF-1所介導的胰島素信號轉導系統紊亂相關[4]。IGF-1是一種重要的神經營養因子，其受體IGF-1R在神經系統中大量表達。有報道證明IGF-1在AD等神經退化性疾病中具有重要作用(如IGF-1可以影響Aβ的清除和tau蛋白的磷酸化)，此過程與PI3K/AKT 和MAPK/ERK1/2信號通路有關[5]。本研究在前期的實驗中亦得出相同結論，并發現此過程涉及IGF-1調控PRNP基因的表達。為進一步了解IGF-1調節PRNP基因表達的機制，本研究首先選擇其中一條信號通路，即IGF-1-PI3K/AKT-PRNP通路，進行詳細研究。

研究表明，PI3K/AKT信號通路可以作為治療神經系統退行性疾病的重要方向和突破口[6]。生長因子等可激活PI3K通路，激活AKT磷酸化，進而磷酸化凋亡基因，使其失活，抑制神經元凋亡，促進神經元的存活[7]。LY294002[2-(4-馬啉基)-8-苯基-4-氫-1-苯并吡喃-4-酮]是類黃酮衍生物的一種，抑制PI3K活性的機制是通過可逆競爭PI3K的ATP結合位點，其具有的特異性抑制作用，常被應用于PI3K相關的細胞功能的研究中[8]。FoxO蛋白是胰島素類似生長因子/胰島素信號通路下游一個重要的轉錄因子，人類有4個FoxO同源基因，分別為FoxO1、FoxO2、FoxO3a和FoxO4。FoxO轉錄因子(FoxO1、FoxO3a)廣泛表達于成人的各組織器官中，包括心、腦等[9]。近年來，人們通過對神經細胞的研究，發現FoxO3a涉及兩方面的功能：既可以促進神經細胞存活、增殖(PI3K/AKT通路被激活時磷酸化或Sirt1調控下去乙?；?，也可以誘導神經細胞凋亡(在PI3K/AKT通路受抑制時去磷酸化或p300調節下乙?；?[10]。

AKT存在于各種不同類型細胞中，是PI3K下游調控器，FoxO是AKT的一下游靶點，AKT通過磷酸化方式來實現調節FoxO3a的活動。研究表明磷酸化的AKT可以抑制 FoxO3a在細胞內的活動，進而抑制其促凋亡信號的傳導[11]。本研究結果顯示，IGF-1可提高PC12細胞PRNP mRNA，這與前期研究一致；加入LY294002的PC12細胞由IGF-1導致的PRNP mRNA表達上調被抑制，并呈劑量依賴性。同樣，AKT的磷酸化水平也可被IGF-1誘導提高，但被LY294002抑制。FoxO3a蛋白表達不受二者影響，但FoxO3a蛋白磷酸化水平發生顯著變化，其趨勢與pAKT相同。提示，IGF-1 對PNRP的調節作用可能是通過PI3K/AKT/FoxO信號通路實現的，AKT及FoxO3a蛋白磷酸化的變化可能在其中起到重要調控作用。

綜上所述，IGF-1能夠通過PI3K/AKT/FoxO信號通路調控PC12細胞PRNP基因的表達，進而引起相關疾病(如AD等)的發生。該過程可能的機制為：IGF-1可以激活PI3K/AKT信號通路，先是磷酸化AKT，然后進一步磷酸化FoxO3a，進而抑制了FoxO3a對PRNP基因的負調控功能，最終導致PRNP基因表達增強。但FoxO3a磷酸化后其在細胞內是如何分配定位及采用何種方式調節尚不明確。此外，磷酸化的AKT對FoxO3a活性是否還存在其他影響，以及FoxO3a蛋白是否直接影響PRNP基因表達等也有待進一步研究。

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Effects of PI3K/Akt/FoxO signaling pathway on PRNP expression of insulin-like growth factor 1 regulating nerve cells

JIANGGuohong,WANGChangming,ZHANGLi

(TheAffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,Zunyi563003,China)

Objective To explore the effects of phosphatidyl inositol 3-kinase (PI3K)/protein kinase B (Akt)/forkhead box O(FoxO) signaling pathway on PRNP expression of insulin-like growth factor 1 (IGF-1) regulating nerve cells PC12. Methods PC12 cells in logarithmic phase were divided into IGF-1 group, experiment group 1, experiment group 2 and the control group. The cells in the IGF-1 group were added with 80 ng/ml IGF-1, cells in the experiment group 1 and experiment group 2 were separately added with 25 and 50 μmol/L LY294002, followed by 80 ng/ml IGF-1 after 30 min 37℃ cultivation. The control group was not given drugs. After 24 h of cultivation, the PRNP mRNA expression of PC12 cells was calculated by real-time fluorescent quantitative PCR in each group. The AKT phosphorylation, AKT phosphorylation (pAKT), FoxO3a and FoxO3a (pFoxO3a) protein expression of PC12 cells was measured by Western blotting in each group. Results The PRNP mRNA and pAKT, pFoxO3a protein expression of the IGF-1 group was higher than that of the control group (allP<0.05). The PRNP mRNA and pAKT, pFoxO3a protein expression of experiment group 1 and experiment group 2 was lower than that of the IGF-1 group (allP<0.05), and the experimental group 2 was lower than the experimental group 1 (P<0.05). Conclusion IGF 1 could regulate PRNP gene expression of PC12 cells through phosphorylation PI3K/Akt/ FoxO signaling pathway proteins Akt and FoxO3a.

phosphatidyl inositol 3-kinase; protein kinase B; forkhead box O; insulin-like growth factor 1; PRNP gene

貴州省科學技術基金資助項目(黔科合LH字-2015-7466號)。

蔣國紅(1979-)，男，漢，碩士研究生，主要研究方向為神經退行性疾病及腦血管病基礎與臨床。E-mail： 421855696@qq.com

王長明(1975-)，男，碩士研究生，副主任醫師，主要研究方向為神經退化性疾病及腦血管病基礎與臨床。E-mail： 421855696@qq.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.11.006

R741.05

A

1002-266X(2017)11-0019-03

2016-10-22)