化瘀解毒中藥對梗阻性腎病大鼠腎臟類肝素酶表達的調控作用*

河北醫科大學第一醫院

馬國平 賈彥存△郝 娟△△王佳磊△△△楊 帆△△張 宇△△梁文杰△△(石家莊 050030)

化瘀解毒中藥對梗阻性腎病大鼠腎臟類肝素酶表達的調控作用*

河北醫科大學第一醫院

馬國平 賈彥存△郝 娟△△王佳磊△△△楊 帆△△張 宇△△梁文杰△△(石家莊 050030)

目的：觀察化瘀解毒中藥對梗阻性腎病大鼠腎臟類肝素酶(Hpa)表達的影響，以探索其拮抗炎癥損傷的機制。方法：采用單側輸尿管結扎手術復制梗阻性腎病模型；采用real-timePCR技術檢測腎組織HpamRNA的表達；采用SABC法檢測腎組織Hpa蛋白的表達。結果：與假手術組比較，模型組大鼠腎組織HpamRNA及蛋白表達上調(P<0.01)；與模型組比較，中藥組腎組織Hpa表達下降(P<0.01)。結論：化瘀解毒中藥可下調梗阻性腎病大鼠腎臟Hpa表達從而減輕炎癥損傷。

化瘀解毒中藥；類肝素酶；梗阻性腎病；炎癥損傷

在慢性腎臟病進程中，常伴隨炎癥反應及其導致的炎癥損傷，而巨噬細胞及中性粒細胞等炎細胞的活化和浸潤是腎組織炎癥反應的重要病理特征。炎細胞浸潤需穿越基底膜和細胞外基質(ECM)，硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)是其主要成分之一，而類肝素酶(Hpa)可裂解HSPG的硫酸乙酰肝素(HS)側鏈。故而Hpa促進細胞侵襲，在炎細胞浸潤中起著極其重要的作用。本實驗采用大鼠單側輸尿管結扎(UUO)方式，復制梗阻性腎病病變，給以化瘀解毒中藥干預治療，觀察Hpa在UUO大鼠腎組織的表達，并觀察化瘀解毒中藥的調控作用，以探索炎癥損傷的分子機制，從而為慢性腎臟病的中藥治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 RNA提取試劑盒為美國Omega Bio-Tek公司產品，批號：00R6934010000L18O094；SYBR Green熒光定量PCR試劑盒為Vazyme Biotech Co.，Ltd產品，批號402151；Hpa抗體為美國Proteintech產品，批號00036315。實時熒光定量基因擴增儀，美國 Applied Biosystems 公司，型號：7500 Fast；超微量紫外分光光度計，型號：ND-2000，美國thermo scientific公司；顯微鏡，日本奧林巴斯，型號：VANOX DM-10AD。

1.2 動物分組及模型制備 清潔級雄性SD大鼠，8周齡，體質量(180±20)g，購于河北醫科大學實驗動物中心，合格證編號: 1605369。30只SD大鼠隨機分為假手術(SHAM)組、模型(UUO)組及中藥(TCM)組，每組10只。大鼠單側輸尿管梗阻模型制備參照 Qian HS 方法。[1]

1.3 藥物及干預方法 化瘀解毒中藥(黃芪、醋鱉甲、僵蠶、烏梢蛇、地龍、赤芍、丹參、黃芩、金銀花、蒲公英、大黃)采用廣東一方制藥有限公司免煎顆粒中藥，常規煎煮。術后開始給藥，TCM組給予化瘀解毒中藥煎劑生藥含量13.7 g/kg·d-1，SHAM組及UUO組給予等容量生理鹽水。連續干預10 d。

1.4 檢測指標及方法

1.4.1 腎組織Hpa mRNA 表達檢測:采用 Real-time PCR 法。常規提取腎組織總RNA，反轉錄為cDNA，擴增。Template 1 μL，4×Gdna wiper Mix 10 μL，ddH2O 6.6 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，Forward primer(10 μM) 1 μL, Reverse primer(10 μM)1 μL，Total volume 20 μL。擴增條件：95℃預變性2 min，兩步法循環反應(95℃10 sec，60℃ 1 min)40個循環，融解曲線95℃ 15 sec，60℃ 60 sec，95℃ 15 sec。引物由 Invitrogen 公司合成，Hpa：Forward primer: 5'-ctctctcctgttcaagaaact-3'，Reverse primer: 5'-ttcccgataccttgggtgatag-3'；GAPDH：Forward primer: 5'-ttgtcagcaatgcatcctgc-3'，Reverse primer: 5'-cggcatgtcagatccacaac-3'。以GADPH為內參照基因，得到目的基因的Ct值，以RQ值表示基因相對表達量，RQ=2-△△Ct。

1.4.2 免疫組化(SABC)法檢測Hpa蛋白表達:[2]石蠟切片脫蠟、水化，0.01 M PBS清洗3次，5 min/次；室溫下0.3%H2O2孵育20 min；同上清洗；0.01 M枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)微波爐內熱修復，98℃20 min；冷卻后同上清洗 ，滴加山羊血清封閉液，37℃濕盒孵育30 min；吸去多余封閉液，加入兔抗鼠Hpa一抗(1∶100)，4℃過夜；同上清洗 ；滴加生物素標記的羊抗兔二抗，37℃濕盒孵育1 h；同上清洗；滴加 SABC 復合物，37℃濕盒孵育30 min；同上清洗；DAB顯色；蒸餾水沖洗；蘇木素復染；梯度酒精脫水；二甲苯透明；中性樹膠封片。顯微鏡觀察Hpa表達情況及位置，以光鏡下出現棕黃色顆粒為陽性表達。醫學圖文圖像分析系統分析。

1.5 統計學方法 采用SPSS13.0 統計軟件進行數據分析。

2 結果

2.1 各組大鼠腎臟Hpa mRNA表達比較 與假手術組比較，模型組大鼠腎臟Hpa mRNA表達明顯上調(P<0.01)；而與模型組比較，中藥組大鼠腎臟的HpamRNA表達明顯下調(P<0.01)。詳見表1、圖1。

組別nmRNA(RQ) 假手術組100.855±0.249 模型組1011.682±1.105*中藥組103.417±0.980△

注：與假手術組比較，*P<0.01；與模型組比較，△P<0.01

注：與假手術組比，﹡P<0.01；與模型組比，△P<0.01

圖1 各組大鼠腎組織Hpa mRNA表達比較

2.2 各組大鼠腎組織Hpa蛋白表達 免疫組化結果顯示，假手術組大鼠腎臟Hpa蛋白微量表達；與假手術組比較，模型組腎臟Hpa表達明顯增強(P<0.01)，主要表達在遠端小管及部分腎間質；與模型組比較，中藥組腎臟Hpa表達明顯減弱P<0.05。詳見表2及圖2。

組別nHpa平均光度值假手術組100.174±0.026 模型組100.310±0.050*中藥組100.243±0.057△

注：與假手術組比較，*P<0.01；與模型組比較，△P<0.05

注：A為假手術組；B為模型組；C為中藥組

3 討論

各種慢性腎臟病發展為終末期腎病的重要原因是腎臟炎癥反應及其組織損傷，炎細胞的活化和浸潤是微生物性及非微生物性炎癥的共有特征。在梗阻性腎病，腎小管損傷、基質堆積及炎細胞浸潤是常見的病理表現。[3]前期研究顯示，[4]模型組大鼠患側腎臟腎組織單核細胞趨化因子1等炎性因子表達明顯上調，炎細胞浸潤明顯，但確切機制尚不完全清楚。炎細胞浸潤必須穿越基底膜和ECM，HSPG是其主要成分之一，HSPG是一種高硫酸化的多聚糖，遍布ECM及細胞表面。而Hpa是唯一獲知的哺乳動物糖苷內切酶，可裂解HSPG的HS側鏈， HS鏈聯結并組裝ECM蛋白，對于ECM的完整性及阻滯功能十分重要。Hpa通過降解HS鏈重構ECM，促進炎細胞浸潤，影響著炎癥反應，甚至促進蛋白尿形成及腎纖維化進程。[5-6]Hpa基因敲除鼠的腎實質未見顯著的巨噬細胞浸潤，而野生鼠浸潤明顯。[7]腎臟炎性細胞浸潤嚴重的慢性腎炎患者，腎組織Hpa表達往往增強，炎細胞浸潤處更甚。[8]本實驗顯示，模型組大鼠腎臟Hpa mRNA及蛋白的表達明顯上調，有利于巨噬細胞等炎細胞穿越血管壁及ECM，從而加重炎癥反應。

Hpa通過降解HS產生透明質酸、核心蛋白聚糖、可溶性二聚糖等，這些裂解產物是Toll樣受體(TLRs)的配體，可與巨噬細胞胞膜的TLR2及TLR4結合，活化的TLRs進一步激活NF-κB，NF-κB轉位胞核，啟動TNFα、MCP-1及IL-1等炎性因子的基因表達。Hpa可使細胞膜的HSPG發生構象改變而激活TLRs。故Hpa不僅促進炎細胞浸潤，而且可以激活巨噬細胞，誘導炎性因子表達。而活化的巨噬細胞產生TNFα增多，TNFα介導Egr1轉錄因子(Hpa的強力誘導劑)的活化，進一步上調Hpa表達。[9]這樣Hpa與巨噬細胞相互作用，加速并加重了腎臟炎癥損傷。

某些中藥復方可抑制腎臟Hpa表達，Sun W等[10]報道，益氣養陰方(地黃、山藥、生黃芪、黨參、丹參、當歸、茯苓、益母草、白術、龜甲)可能通過抑制腎臟Hpa表達而減輕腎小球足突損傷，改善蛋白尿。炎細胞浸潤及炎性因子產生為“濁毒”的物質基礎，本研究顯示，化瘀解毒中藥可從基因、蛋白水平上明顯抑制Hpa表達，減弱腎臟濁毒的形成。Hpa表達減少可降低巨噬細胞等炎細胞的浸潤，并抑制巨噬細胞活化，減少炎性因子的生成，從而減輕腎臟炎癥損傷，改善腎功能。化瘀解毒中藥中的地龍、僵蠶、蟬蛻、鱉甲等可化瘀通絡，大黃、黃芩、金銀花、蒲公英等可解毒瀉濁，加之赤芍、丹參的活血作用及黃芪的益氣作用，使其在臨床上具有較好的減輕炎癥損傷、改善腎功能的功效。

[1]QianHS,WeldonSM,MateraD,etal.QuantificationandComparisonofAnti-FibroticTherapiesbyPolarizedSRMandSHG-BasedMorphometryinRatUUOModel[J].PLoSOne,2016,11(6):e0156 734

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(2016-12-30 收稿)

Effect of Stasis-resolving and Toxin-removing Chinese Medicine on Heparanases Expression in Obstructive Nephropathy Rats First Hospital of Hebei Medical University

(Shijiazhuang 050030)

MAGuo-pingJIAYan-cunHAOJuanWANGJia-leiYANGFanZHANGYuLIANGWen-jie

Objective: to observe the effect of stasis-resolving and toxin-removing Chinese medicine on heparanases (Hpa) expression in obstructive nephropathy rats so to explore its mechanism of anti-inflammatory injury. Methods: Take unilateral ureteral obstruction to duplicate obstructive nephropathy models; take real-time technique to detect Hpa mRNA expression; take SABC to detect Hpa protein expression. Results: compared to sham operation group, Hpa mRNA expression of model group increased (P<0.01);comparedtomodelgroup,Hpaexpressionofmedicinegroupdecreased(P<0.01).Conclusion:Stasis-resolvingandtoxin-removingChinesemedicinecandecreasetheHpaexpressioninobstructivenephropathyratsandsoastolightentheinflammatoryinjury.

stasis-resolving and toxin-removing Chinese medicine; heparanases (Hpa); obstructive nephropathy; inflammatory injury

*河北省科技計劃項目：No.152777208

梁文杰，男，副教授，碩士生導師。

R

A

1007-5615(2017)02-0005-03

△河北省安平縣醫院

△△河北中醫學院 河北省中西醫結合肝腎病證重點實驗室

△△△河北醫科大學(石家莊050017)