吳茱萸次堿的制備方法※

李 琦 曹青云 肖順麗 王 敏 關亮俊 張宏桂

(北京中醫藥大學中藥學院2015級碩士研究生，北京 100102)

制劑與質量控制

吳茱萸次堿的制備方法※

李 琦 曹青云 肖順麗 王 敏 關亮俊 張宏桂△

(北京中醫藥大學中藥學院2015級碩士研究生，北京 100102)

目的 以吳茱萸為原料，研究簡單、快速、高效的分離、純化吳茱萸次堿的制備方法。方法 采用85%乙醇提取，硅膠柱層析分離，甲醇重結晶純化吳茱萸次堿，薄層鑒別(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)、核磁方法檢查純度。結果 吳茱萸次堿經TLC檢查與對照品一致，無雜質斑點，經HPLC檢測純度達98.5%以上，經核磁鑒定。另外經考察，確定色譜條件為Waters C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；檢測波長225、290、215、365 nm；流動相乙腈-水溶液(50∶50)；進樣量10 μL；柱溫35 ℃；體積流量1.0 mL/min。結論 吳茱萸次堿對照品已達到中藥質量檢測用化學對照品技術要求，所采取的分離、純化方法簡單、安全、可行性強，成本低、效率高，可用于吳茱萸藥材及其制劑的質量控制。

生物堿類;吳茱萸;化學;制備

吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸Evodiarutaecarpa(Juss.) Benth.、石虎Euodiarutaecarpa(Juss.) Benth.Var.officinalis(Dode) Huang或疏毛吳茱萸Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth. Var.bodinieri(Dode) Huang的干燥近成熟果實，散寒止痛，降逆止嘔，助陽止瀉，用于厥陰頭痛、寒疝腹痛、寒濕腳氣、經行腹痛、脘腹脹痛、嘔吐吞酸及五更泄瀉[1]。近代醫學研究證明吳茱萸有鎮痛[2]、安神[3]、抗菌[4]、降血壓[5]和抗缺氧[6]等藥理作用。吳茱萸含有多種化學成分，其中生物堿類成分是吳茱萸的主要活性成分[7]。吳茱萸次堿是吳茱萸的主要活性成分之一，具有增加冠脈血流量[8]，舒張血管、降血壓[9]，抗血小板聚集[10-11]，腦保護作用[12]，調節糖脂代謝[13]，抗癌、抗炎、抗潰瘍、松弛非血管平滑肌、抗缺氧等藥理作用[14]。昶國平等[15]分離周期長，且用丙酮重結晶，危害性大。為了研究更簡單、快速、高效的分離、純化吳茱萸次堿的制備方法，本試驗用一次硅膠柱層析分離，甲醇重結晶的方法，高效率制得純度在98.5%以上的吳茱萸次堿。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 Waters 1525型高效液相色譜儀，Waters 2489型紫外可見檢測器；色譜柱為Waters C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；薄層色譜及柱色譜用硅膠(青島海洋化工廠)；色譜純乙腈(Calipure進口分裝)；吳茱萸藥材購自云南昆明藥材市場，經北京中醫藥大學張貴君教授鑒定為Evodiarutaecarpa(Juss.)Benth.的干燥近成熟果實。

1.2 方法

1.2.1 裝柱 取200～300目硅膠1.5 kg溶于石油醚中，攪拌均勻后裝入層析柱(φ15 cm×60 cm的玻璃層析柱)。石油醚為流動相，常壓沉降硅膠1周備用。

1.2.2 提取與分離 取吳茱萸藥材0.5 kg，用粉碎機稍加粉碎，裝入10 L圓底燒瓶中，用10倍量石油醚脫油脂1次(2 h)，趁熱過濾，得殘渣和濾液，濾液回收石油醚，殘渣再次放入圓底燒瓶中，用10倍量85%乙醇提取3次，每次2 h，合并3次提取液。將提取液濃縮至無醇味。加適量水，有大量沉淀析出，過濾，得黑綠色沉淀物101.12 g，于通風櫥中揮干溶劑，減壓干燥箱中干燥(55 ℃)24 h，研缽中研磨。細粉過80目篩后，直接干法上樣，用石油醚-乙酸乙酯(v∶v,5∶1)洗脫，按照1滴/s的流速收集流分于圓底燒瓶中，500 mL后換瓶，流分至5 000 mL后開始有白色雪花狀結晶析出，為吳茱萸次堿粗品。結合色帶顏色收集流分，收集液(40 ℃)減壓回收溶劑后，點硅膠板合并有相同目標物的流分。常溫放置一段時間后得黃白色粗品1.2 g。

重結晶：將粗品用甲醇溶解成過飽和狀態，放入冰箱中，低溫重結晶，如此反復3次，干燥后即淡黃色吳茱萸次堿純品0.5 g。

1.2.3 結構鑒定1H-NMR(500 MHz, CDCl3)，δ: 9.606(1H, br s, N-H-1), 8.327(1H, dd, J=1.5 Hz, J=8.0 Hz, H-19),7.763(1H, dt, J=1.5, J=8.0 Hz, J=8.5 Hz, H-17), 7.440(1H, d, J=8.0 Hz, H-16), 7.426(1H, d, J=8.0 Hz, H-9), 7.410(1H, d, J=8.5 Hz, H-12), 7.342(IH, d, J=8.0 Hz, H-18), 7.306(1H, t, J=8.0, 7.0 Hz, H-11), 7.147(1H, t, J=7.5, 7.5 Hz, H-10), 4.594(2H, t, J=7.0, 7.0 Hz,H-5), 3.239(2H, t, t=7.0, 6.5 Hz, H-6)，與文獻的吳茱萸氫譜數據吻合[16]。

1.2.4 純度測定

1.2.4.1 TLC檢測 分別以石油醚-丙酮(5∶1)、石油醚-正丁醇(6∶1)、石油醚-乙酸乙酯(5∶2)為展開劑進行硅膠薄層層析。紫外燈365 nm下觀察樣品與對照品Rf比對。

1.2.4.2 高效液相色譜法 色譜條件，色譜柱：Waters C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-水溶液 (50∶50)，按2015年版《中華人民共和國藥典》[1]中的規定進行等度洗脫；流速：1.0 mL/min；檢測波長：225、290、215、365 nm；柱溫：35 ℃。在該色譜條件下，理論塔板數按照吳茱萸次堿峰計應不低于3 000。

取吳茱萸次堿適量，加甲醇溶解制成每1 mL含1 mg化合物的溶液，作為供試品，然后取空白溶劑(甲醇)和供試品溶液各10 μL，按上述色譜條件測定。

1.2.5 色譜條件考察

1.2.5.1 檢測波長的考察 《中華人民共和國藥典》[1]吳茱萸次堿的檢測波長為215 nm，將215 nm作為吳茱萸次堿的檢測波長。為了使吳茱萸次堿純度確信，又選擇225、290、365 nm檢測波長[17-18]。

1.2.5.2 流量的考察 取吳茱萸次堿供試液適量，分別設置體積流量為0.8、1.0、1.2 mL/min，進行考察。

1.2.5.3 色譜柱的考察 取吳茱萸次堿供試液適量，以檢測波長215 nm、柱溫35 ℃、流動相甲醇-水(80∶20)、體積流量1 mL/min、進樣量10 μL為色譜條件，分別采用Sunfire TM C18(4.6 mm×200 mm，5 μm)、Agilent C8(4.6 mm×150 mm，5 μm)、Waters C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱進行測定。

1.2.5.4 柱溫的考察 取吳茱萸次堿供試液適量，分別設置柱溫為25、30、35 ℃，進行考察。

2 結 果

2.1 TCL檢測結果 經3個展開系統方式檢測時，TLC上均呈現單一斑點，而且未見雜質，且樣品與對照品Rf相同。

2.2 HPLC檢測結果 扣除溶劑干擾峰后，吳茱萸次堿的色譜峰面積歸一化含有量在各波長均>99%，相應的樣品與對照品出峰時間一致，在各個波長下的含量分別為215 nm的純度為98.5%，在295 nm的純度為99.1%，茱萸次堿225 nm的純度為99.4%，在365 nm的純度為99.6%說明樣品的純度符合化學對照品的質量要求，如圖1所示。

注：(a)215 nm (b)225 nm (c)295 nm (d)365 nm

2.3 流量考察的結果 見表1。

表1 流量研究結果

由表1可見，當體積流量為1.0 mL/min時，對稱因子和理論塔板數最高。

2.4 色譜柱考察結果 見表2。

表2 色譜柱考察結果

由表2可知，當色譜柱為HederaC18(4.6 mm×200 mm，5 μm)時，對稱因子和理論塔板數最好。

2.5 柱溫考察結果 見表3。

表3 柱溫考察結果

由表3可知，當柱溫為35 ℃時，基線穩定，對稱因子最高。

3 討 論

本方法在短時間里，應用簡單且毒害低的提取分離方法，從吳茱萸中分離出符合2015年版《中華人民共和國藥典》(一部)[1]標準的吳茱萸次堿對照品，而且路線簡單可靠，可用于吳茱萸藥材及其制劑的質量控制。

3.1 提取前的準備工作 吳茱萸含有很多小分子的脂溶性成分[19]，直接用乙醇提取，提取溶液特別黏稠，增加分離工作的負擔，不利于后期處理。實驗用乙醇提取之前，用石油醚脫脂，既減少油脂雜質，又為后期分離減輕工作量。

3.2 樣品的處理 濃縮得到墨綠色沉淀后，昶國平等[15]選用二氯甲烷加熱溶解，本試驗在前人基礎上選擇用二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇以及甲醇與乙酸乙酯混合溶劑加熱溶解，溶解度都非常小，浪費了大量的溶劑和時間，且二氯甲烷沸點低且毒性較大，導致頭暈、頭痛、惡心、嘔吐、手腳麻木、疲勞、協調性降低以及眼和上呼吸道刺激癥狀，高濃度暴露可能導致共濟失調、意識喪失甚至死亡[20]，增加了試驗的不安全性。本試驗最后采用樣品直接上柱法，沉淀烘干后，打粉，過篩，上柱，免去硅膠分散干膏粉的傳統工序，既節約試劑，又節約時間。在保證分離效果的前提下簡化了分離工藝，節省了試劑和時間，提高了分離效率，降低了生產成本，保證試驗的安全有效。

3.3 甲醇重結晶 昶國平等[15]采用丙酮重結晶，而本試驗采用甲醇重結晶。丙酮在應用中極易發生泄漏、中毒、火災、爆炸及環境污染等事故，對中樞神經系統的麻醉作用，出現乏力，惡心，頭痛，頭暈，易激動，重者發生嘔吐、氣急、痙攣，甚至昏迷，對眼、鼻、喉有刺激性[21]。用甲醇重結晶，一方面重結晶的次數減少，縮短了結晶的時間，另外減少對環境的污染，控制一些可變因素，增加試驗的安全性。

3.4 波長的考察 昶國平等[15]用雙波長檢測吳茱萸次堿，225 nm的純度為98.5%，在290 nm的純度為98.8%。鮑天冬等[17]研究用高效液相色譜法同時測定制吳茱萸及其提取物中吳茱萸堿、吳茱萸次堿和吳茱萸內酯含量，選取225 nm作為檢測波長。王世永等[18]研究吳茱萸中吳茱萸堿和次堿的提取及測定，選取290 nm作為檢測波長。而本試驗選取225、290、215、365 nm 4個波長檢測，更能準確地反映真實純度。

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(本文編輯：董軍杰)

Preparation method of rutaecarpine

LIQi,CAOQingyun,XIAOShunli,etal.

2015-GradeMasterofChineseMedicineCollegeinBeijingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Beijing100102

Objective Using evodia as the material, to study a simple, rapid and efficient preparation method for the separation and purification of rutaecarpine. Methods The rutaecarpin were prepared by using 85% ethanol extraction, silica-gel column chromatography separation and methanol recrystallization purification. The purity was checked by thin layer identification (TLC), high performance liquid chromatography (HPLC) and nuclear magnetic resonance (NMR). Results Rutaecarpine was consistent with the reference substance upon TLC, without impurities and spots, the purity over 98.5% upon HPLC, which identified by NMR. In addition, the chromatographic conditions were determined as Waters C18column (150 mm × 4.6 mm, 5 μm), determine wavelengths: 225, 290, 215, 365 nm; moving phase: acetonitrile-aqueous solution (50∶50); sample size: 10 μL; column temperature: 35 ℃; volume flow rate: 1.0 mL/min. Conclusion Rutaecarpine reference substance has reached the technical requirements of Traditional Chinese medicine with chemical reference materials, the method for separation and purification is simple, safe, strong feasibility, low cost, high efficiency, can be used for the quality control of evodia medicinal materials and its preparations.

Alkaloids; Evodia; Chemistry; Preparation

10.3969/j.issn.1002-2619.2017.03.031

※ 項目來源：國家自然科學基金資助項目(編號：30870262)

李琦(1991—)，女，碩士研究生在讀。研究方向：中藥有效物質基礎研究。

R282.71;R284.1

A

1002-2619(2017)03-0439-05

2017-01-13)

△ 通訊作者：北京中醫藥大學中藥學院科技發展部，北京 100102