四物湯對非酒精性脂肪性肝病小鼠的作用機制研究

王家華 梁丹紅

(廣東省東莞市中醫院消化內科，廣東 東莞 523000)

四物湯對非酒精性脂肪性肝病小鼠的作用機制研究

王家華 梁丹紅

(廣東省東莞市中醫院消化內科，廣東 東莞 523000)

目的 研究四物湯對非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)小鼠的作用機制。方法 將60只C57健康雄性小鼠適應性喂養5 d后，按照隨機數字表法分為5組，分別為正常對照組，模型組，四物湯低、中、高劑量組，每組各12只。正常對照組小鼠予正常飼料喂養，其余4組小鼠予高脂飼料喂養，自由進食，連續4周，建立NAFLD模型。造模成功后，正常對照組及模型組小鼠予0.9%氯化鈉注射液0.2 mL/100 g灌胃，四物湯低、中、高劑量組小鼠分別予0.05、0.10、0.20 mL/100 g四物湯藥液灌胃，均每日2次，連續6周。然后取各組小鼠血清標本，檢測血清甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)水平；取肝組織，檢測游離脂肪酸(FFA)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)及超氧化物歧化酶(SOD)活性，并對肝臟組織形態學進行觀察。結果 與正常對照組相比，模型組小鼠血清TG、TC、ALT、AST水平均增高(P<0.05)，HDL-C水平降低(P<0.05)。與模型組相比，四物湯低、中、高劑量組小鼠血清TG、TC、ALT、AST水平均顯著降低(P<0.05)，HDL-C水平增高(P<0.05)，且與正常對照組比較差異均無統計學意義(P>0.05)。與正常對照組相比，模型組肝組織MDA、FFA活性均升高(P<0.05)，GSH-Px、SOD活性均降低(P<0.05)；與模型組相比，四物湯低、中、高劑量組肝組織MDA、FFA活性均降低(P<0.05)，GSH-Px、SOD活性均增高(P<0.05)，且與正常對照組比較差異均無統計學意義(P>0.05)。結論 四物湯可通過調節血脂水平，改善脂質代謝紊亂，提高肝臟抗氧化能力，從而起到控制NAFLD進展以及其惡化程度的作用。

脂肪肝；四物湯；氧化性應激；脂肪酸類，非酯化；模型，動物；藥理作用

因酒精外因素導致的以彌漫性大泡狀肝細胞脂肪病變為主要病理性肝損傷的疾病被稱為非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)，其主要臨床疾病為單純性脂肪肝及因脂肪肝導致的肝硬化、脂肪性肝炎。現代醫學研究認為，脂質在肝細胞中發生沉積，并對肝細胞造成過氧化損傷，是造成脂肪肝的主要原因，而中醫學多認為痰濁、血瘀是本病的主要病理因素[1]。四物湯由當歸、地黃、白芍和川芎組成，具有補血養肝、行瘀破滯的功效[2]。現代醫學研究顯示，四物湯能增強血清超氧化物歧化酶(SOD)活性，有效清除氧自由基[3]，對小鼠酒精性肝損傷具有一定的保護作用[4]，然而對NAFLD的保護作用及作用機制目前尚未有相關研究。本研究以C57系小鼠為研究對象，觀察四物湯對NAFLD實驗小鼠血脂、肝功能、肝細胞形態學以及肝細胞脂質氧化相關細胞的影響，并探討其具體作用機制，為臨床治療提供實驗支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 C57雄性小鼠60只[SPF級，軍事醫學科學院實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK(軍)2016-0004]，分籠喂養于23～24 ℃明暗各12 h的動物實驗室內。

1.1.2 實驗藥品及試劑 四物湯顆粒由廣東省東莞市中醫院藥劑科制備。藥物組成：川芎69 g，當歸99 g，熟地黃99 g，白芍69 g，加入500 mL水，大火煮沸后，溫火收水至100 mL，濾過雜質后放置備用。甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、丙二醛(MDA)、游離脂肪酸(FFA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)以及超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；四氯化碳(CC14)購自南京南試化學試劑有限公司；高脂飼料配比為膽固醇1%，膽酸鹽0.5%，甲基硫氧嘧啶0.2%，豬油2%，黃豆5%，雞蛋及魚粉1%，蛋黃粉2%，基礎飼料88.3%。

1.1.3 主要儀器 GL-24MC超高速冷凍離心機，上海凌儀實業有限公司；LC-2010高壓液相色譜儀，日本島津公司；Synergy H1全功能酶標儀，美國伯騰儀器有限公司(BioTek)；光學顯微鏡，德國徠卡(Leica Camera AG)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組 將60只健康雄性C57小鼠適應性喂養5 d后，按照隨機數字表法分為5組，分別為正常對照組，模型組，四物湯低、中、高劑量組，每組各12只。

1.2.2 模型制備 正常對照組小鼠予正常飼料喂養，其余4組小鼠予高脂飼料喂養，自由進食，連續4周。

1.2.3 給藥方法 造模成功后，正常對照組及模型組小鼠予0.9%氯化鈉注射液0.2 mL/100 g灌胃，四物湯低、中、高劑量組小鼠分別予0.05、0.10、0.20 mL/100 g四物湯藥液灌胃，均每日2次，連續6周。

1.2.4 樣本處理 5組小鼠最后一次灌胃給藥后，禁食12 h，10%水合氯醛腹腔麻醉處死，心尖取血，低溫離心(4.0 ℃，3 000 r/min，離心30 min)，取血清低溫(-80 ℃)保存待檢。解剖各組小鼠，分離肝臟，取出，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗，取肝臟左葉置于10%甲醛溶液中固定，備做病理切片。

1.2.5 觀察指標及方法

1.2.5.1 血液相關指標 取血清標本，檢測血清TG、TC、HDL-C、ALT、AST水平。

1.2.5.2 肝臟生化指標 取肝組織1 g，按1∶9的比例，加入9倍容積的0.9%氯化鈉注射液制組織勻漿，以2 500 r/min離心10 min，取上清液，分別檢測MDA、FFA、GSH和SOD活性。

1.2.5.3 肝臟形態觀察 取甲醛溶液固定后的肝臟組織，流水沖洗6～12 h，經脫水、透明、浸蠟、包埋、切片(厚約7 μm)、脫蠟、蘇木精—伊紅(HE)染色、脫水及封片處理后，400倍光鏡下觀察其形態變化。

2 結 果

2.1 5組小鼠血清TG、TC及HDL-C水平比較 見表1。

組 別nTGTCHDL-C正常對照組121.97±0.68*2.69±0.97*1.83±0.19*模型組122.88±1.214.67±1.091.31±0.21四物湯低劑量組122.54±0.57*4.16±0.79*1.51±0.36*四物湯中劑量組122.23±0.79*3.07±0.81*1.62±0.22*四物湯高劑量組122.06±0.67*2.84±0.61*1.81±0.29*

與模型組比較，*P<0.05

由表1可見，與正常對照組相比，模型組小鼠血清TG、TC水平均增高(P<0.05)，HDL-C水平降低(P<0.05)。與模型組相比，四物湯低、中、高劑量組小鼠血清TG、TC水平均顯著降低(P<0.05)，HDL-C水平增高(P<0.05)，且與正常對照組比較差異均無統計學意義(P>0.05)。

2.2 5組小鼠血清ALT、AST水平比較 見表2。

組 別nALTAST正常對照組1228.51±7.94*109.57±29.41*模型組12151.49±32.16204.16±40.16四物湯低劑量組1256.41±11.59*181.51±31.26*四物湯中劑量組1247.59±16.54*164.15±32.44*四物湯高劑量組1234.41±6.91*143.51±29.48*

與模型組比較，*P<0.05

由表2可見，與正常對照組相比，模型組小鼠血清ALT、AST水平均增高(P<0.05)。與模型組相比，四物湯低、中、高劑量組小鼠血清ALT、AST水平均顯著降低(P<0.05)，且與正常對照組比較差異均無統計學意義(P>0.05)。

2.3 5組小鼠肝組織MDA、FFA、GSH-Px及SOD活性比較 見表3。

組 別nMDA(mmol/mgprot)FFA(μmol/gprot)GSH-Px(μmol/L)SOD(U/mgprot)正常對照組122.41±0.47*89.69±8.73*329.74±59.51*78.51±7.94*模型組123.27±0.51120.66±21.49201.43±60.1961.43±9.61四物湯低劑量組123.04±0.54*102.15±13.31*271.31±40.36*64.42±10.52*四物湯中劑量組122.83±0.49*95.31±10.19*291.62±20.22*69.51±9.42*四物湯高劑量組122.46±0.72*90.31±9.16*311.19±30.24*75.42±8.81*

與模型組比較，*P<0.05

由表3可見，與正常對照組相比，模型組肝組織MDA、FFA活性均升高(P<0.05)，GSH-Px、SOD活性均降低(P<0.05)；與模型組相比，四物湯低、中、高劑量組肝組織MDA、FFA活性均降低(P<0.05)，GSH-Px、SOD活性增高(P<0.05)，且與正常對照組比較差異均無統計學意義(P>0.05)。

2.4 5組小鼠肝組織形態學觀察 正常對照組：肝小葉結構正常，肝細胞排列較為整齊，未見壞死、變性等損傷性變化。模型組：肝細胞發生明顯腫大，并且排列較為混亂，胞漿半透明，并有脂肪空泡出現。四物湯低劑量組：肝細胞中度腫大，并且排列較模型組整齊，胞漿仍半透明，脂肪空泡減少。四物湯中劑量組：肝細胞輕度腫大，排列改善明顯，胞漿改善，脂肪空泡較少。四物湯高劑量組：肝細胞未見明顯腫大，排列較為整齊，胞漿改善明顯，未見大面積壞死、變性等損傷。見圖1。

正常對照組 模型組 四物湯低劑量組 四物湯中劑量組 四物湯高劑量組

圖1 5組小鼠肝組織形態學觀察結果(HE×400)

3 討 論

NAFLD是導致諸如血管病變乃至動脈粥樣硬化的主要誘導因素[5]，屬中醫學脅痛、脹滿、肝癖、積聚等范疇，病位主要在于肝、脾；多因飲食失節、嗜食肥甘厚味、過度肥胖、情志失調、感受濕熱疫毒等，導致肝郁脾虛，脾失健運，肝失疏泄，水谷不能化生精微，痰濕內蘊，脂濁積聚引起，為本虛標實之證。四物湯由當歸、白芍、川芎和熟地黃組成，是補血、養血的經典方，常化裁用于治療月經不調、胎產疾病、骨傷科疾病、蕁麻疹、過敏性紫癜、神經性頭痛等屬營血虧虛、血行不暢者。其中當歸、白芍補血活血養肝；熟地黃養血滋陰；川芎活血行氣開郁。現代藥理研究表明，四物湯具有抑制腫瘤、抗缺氧、免疫調節、抗自由基損傷、防止衰老及雙向調節子宮平滑肌等作用；能夠改善微循環，抑制血栓形成，降血脂[6]。進一步研究顯示，四物湯能明顯降低正常動物的TC、TG水平，減少膽固醇在腸道的吸收，加速膽固醇在體內的轉化[7]。基于以上研究基礎，我們通過實驗觀察四物湯對NAFLD的影響。目前，NAFLD的建模方法主要有兩類，一類是利用轉基因技術建模，另一類是利用藥物和飲食誘導建模，而最常用的建模方法是超營養飲食法，這種方法重復性強，較穩定且簡單易行[8]。本研究使用高脂飼料喂養造模顯示，模型組小鼠TG、TC水平均顯著增高(P<0.05)，HDL-C水平顯著降低(P<0.05)。而使用四物湯干預后，低、中、高劑量組小鼠血清TG、TC水平降低(P<0.05)，HDL-C水平升高(P<0.05)，表明四物湯可降低NAFLD小鼠的血脂水平，與文獻研究相似[9]。

目前研究認為，氧化應激及脂質過氧化是NAFLD發病的重要環節。高脂飲食可導致高脂血癥及肝臟脂代謝紊亂，使肝內TG堆積，引起肝細胞脂肪變性，并誘導其對內外源性損害因子的敏感性增高，脂肪變性的肝細胞活力下降，導致反應性氧化代謝產物增多，使促氧化物與抗氧化物之間的動態平衡失調，導致脂質過氧化，引起氧化應激。脂質過氧化可產生大量具有反應活性和細胞毒性的中間產物，加劇肝細胞損傷[10]。MDA水平能夠反映脂質過氧化程度和氧化應激狀態，SOD活性能夠反映抗氧化能力。本研究結果顯示，模型組小鼠肝組織MDA含量增高，SOD活性下降(P<0.05)。GSH-Px是機體內廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，能使有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，同時促進過氧化氫(H2O2)的分解，從而保護細胞膜的結構及功能不受過氧化物的干擾及損害[11]。而本研究模型組小鼠肝臟GSH-Px活性較正常對照組明顯降低(P<0.05)。提示高脂飲食可導致肝組織GSH-Px的損耗，引起氧化與抗氧化失衡。而給予四物湯可阻止肝組織GSH-Px活性下降(P<0.05)，提高抗氧化物SOD的活性(P<0.05)，降低氧化物MDA含量(P<0.05)，從而減弱高脂飲食所致的肝臟脂質過氧化反應，減輕肝細胞損害。

FFA是中性脂肪分解成的物質和熱量的直接來源，具有雙向的生理作用。在正常生理狀態下，FFA在肌肉活動能量耗盡時，可充當人體能量的臨時來源；在病理狀態下，高濃度的FFA有細胞和組織毒性。NAFLD的發生與肥胖有密切關系，肥胖者體內脂肪組織增多，脂肪酸和游離脂肪酸釋放增加，脂肪酸分解下降，此時肝臟中FFA大量蓄積，極低密度脂蛋白合成和分泌發生障礙，脂質代謝紊亂，從而導致肝臟中TG含量增加。高濃度的FFA作用于肝細胞可導致肝脂肪變性，進而啟動NAFLD[12]。本研究證實，NAFLD模型小鼠肝組織FFA水平升高(P<0.05)，而四物湯干預后，FFA水平降低(P<0.05)。

AST和ALT是肝損傷的標志酶，在正常情況下，這些酶主要存在于細胞核和線粒體內，而當細胞膜受到損傷時則會釋放在體液中流通，因此血清AST和ALT升高為肝功能受損的特異性指標。而四物湯能明顯降低血清AST和ALT水平(P<0.05)，與文獻研究相似[13-14]。形態學觀察亦表明，四物湯可保護肝臟不受脂肪的氧化損傷，肝細胞無明顯腫大，排列整齊，胞漿改善明顯，未見大面積壞死、變性。綜上分析，四物湯可通過調節血脂水平，改善脂質代謝紊亂，提高肝臟抗氧化能力，從而控制NAFLD進展以及其惡化程度。

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(本文編輯：曹志娟)

Mechanism study of Siwu decoction on non-alcoholic fatty liver in mice

WANGJiahua,LIANGDanhong.

DepartmentofGastroenterology,DongguanCityHospitalofTraditionalChineseMedicineinGuangdongProvince,Guangdong,Dongguan523000

Objective To study the mechanism of Siwu decoction on non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) in mice. Methods 60 healthy C57 male mice after 5 d adaptive feed were divided into normal group, model control group, Siwu decoction low, middle and high dose group according to random number table, 12 mice in each group. The normal control group was fed by normal forage, the rest four groups were fed by high fat feed, freely eating for 4 weeks. After successful modeling, the mice in normal and model group received 0.9% sodium chloride injection (0.2 mL/100 g) by gavage, the Siwu decoction low, middle and high dose group received Siwu decoction at 0.05 mL/100 g, 0.1 mL/100 g and 0.2 mL/100 g respectively, 2 times a day for 6 weeks. The triglyceride (TG), total cholesterol (TC), high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C), alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) in serum sample were measured. The concentrations of free fatty acid (FFA), malondialdehyde (MDA) and glutathione peroxidase (GSH-Px) and superoxide dismutase (SOD) in liver tissue were measured, and liver pathologic change was observed. Results As compared with normal control group, the serum TG, TC, ALT and AST in model group were increased (P<0.05), and the HDL-C was decreased (P<0.05). As compared with model group, the serum TG, TC, ALT and AST in Siwu decoction low, middle and high dose group were significantly decreased (P<0.05), and the HDL-C was increased (P<0.05). There were no statistical differences on TG, TC, ALT, AST and HDL-C among Siwu decoction low, middle, high dose group and normal control group (P>0.05). As compared with normal control group, the activity of MDA and FFA of liver tissue in model group were increased (P<0.05), and the activity of GSH-Px and SOD were decreased (P<0.05). As compared with model group, the activity of MDA and FFA of liver tissue in Siwu decoction low, middle, high dose group were significantly decreased (P<0.05), and the GSH-Px and SOD were increased (P<0.05). There were no statistical differences on activity of MDA, FFA, GSH-Px and SOD among Siwu decoction low, middle, high dose group and normal control group (P>0.05). Conclusion Siwu decoction can adjust the blood lipid, enhance antioxidant capacity of liver, and improve lipid metabolism disorders, which play a role in controlling the progress of NAFLD and its deterioration degree.

Fatty liver; Siwu decoction; Oxidative stress; Fatty Acids; Non-esterified; Model; Animals; Pharmacological action

10.3969/j.issn.1002-2619.2017.03.026

王家華(1980—)，男，主治中醫師，碩士。從事消化內科診療工作。研究方向：肝病及胃腸疾病。

R575；R285.5

A

1002-2619(2017)03-0420-05

2016-03-15)