腎陽虛證血漿蛋白質(zhì)表達譜的研究※

畢建璐 魏 敏 孫曉敏 聶曉莉 肖 雅 莫 偉 趙曉山 羅 仁

(廣東省第二中醫(yī)院內(nèi)分泌腎病科，廣東 廣州 510095)

腎陽虛證血漿蛋白質(zhì)表達譜的研究※

畢建璐 魏 敏1孫曉敏2聶曉莉2肖 雅3莫 偉 趙曉山2羅 仁△

(廣東省第二中醫(yī)院內(nèi)分泌腎病科，廣東 廣州 510095)

目的 觀察腎陽虛證血漿蛋白質(zhì)表達譜的變化，為腎陽虛證的客觀化研究提供依據(jù)。方法 分別選取典型的腎陽虛證5例、正常健康人6例納入研究，以抗體芯片分析2組人群血漿蛋白質(zhì)表達譜的差異。結果 腎陽虛證組與正常對照組之間存在差異表達上調(diào)的蛋白共14條，其中與生長發(fā)育生殖能力相關的為Src蛋白酪氨酸激酶(Csk)、卷曲蛋白1和4(FZD-1，F(xiàn)ZD-4)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、激活素A受體ⅡA型(ActRⅡA)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-5(BMP-5)、潛在轉(zhuǎn)化生長因子β結合蛋白1(LTBP-1)、成纖維細胞生長因子樣受體1(FGFRL1)，與免疫系統(tǒng)相關的為CXC趨化因子受體3(CXCR3)、白細胞介素27受體α(IL-27Rα)、脂多糖結合蛋白(LBP)、白細胞介素13受體Ⅱα(IL-13Rα2)、集落刺激因子-1(CSF-1)、血小板內(nèi)皮細胞黏附分子1(PECAM-1)、ActRⅡA。結論 腎陽虛證血漿蛋白質(zhì)表達譜的變化涉及生長發(fā)育生殖能力、免疫應答、細胞凋亡等，與中醫(yī)腎陽虛證所表現(xiàn)的腰膝痠軟、耳鳴耳聾、發(fā)脫齒松、性欲減退等癥狀相符。

腎陽虛；蛋白表達譜；胚胎發(fā)育；免疫

現(xiàn)代研究證明，只有極少數(shù)的疾病是因為單一基因出現(xiàn)改變而發(fā)生的，大部分疾病都是因多個基因失調(diào)導致的。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)[1-2]腎陽虛證患者出現(xiàn)多個明顯的基因差異性表達，這些差異涉及多個信號轉(zhuǎn)導通路，如鈣細胞傳導通路、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)信號轉(zhuǎn)導通路、細胞因子間受體相互作用通路等，現(xiàn)代臨床研究結果也證明了這一結果[3-6]。而基因又要在表達相應蛋白質(zhì)的情況下才能影響機體的生物學功能。本研究擬在前期研究基礎之上，采用“病證結合”的方法，以腎陽虛證人群為研究對象，以抗體芯片分析其血漿蛋白質(zhì)表達譜的變化，為腎陽虛證的客觀化指標提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 病例選擇

1.1.1 診斷標準 腎陽虛證的辨證依據(jù)《中醫(yī)虛證辨證參考標準》[7]。主癥：腰膝痠軟，性欲減退，畏寒肢冷。次癥：精神萎靡，夜尿頻多，下肢水腫，動則氣促，發(fā)槁齒搖，舌質(zhì)淡苔白，脈沉遲，尺無力。診斷：主癥具備2項(腰膝痠軟必備)，次癥至少具備2項即可辨證成立。

1.1.2 納入標準 ①年齡在18～60歲之間；②符合腎陽虛證的診斷標準，或正常健康人；③自愿簽署知情同意書。

1.1.3 排除標準 ①不符合納入標準者；②妊娠或哺乳期婦女；③患有心腦血管、肝、腎、造血系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等器質(zhì)性病變者；④精神疾病者。

1.2 一般資料 在南方醫(yī)科大學附屬南方醫(yī)院招募5例典型的腎陽虛證作為腎陽虛證組(基本情況見表1)，6例健康人作為正常對照組。腎陽虛證組5例，男2例，女3例；年齡31～57歲，平均(44.00±11.77)歲。正常對照組6例，男3例，女3例；年齡30～48歲，平均(35.67±6.53)歲。

表1 腎陽虛證組基本情況

1.3 試驗方法

1.3.1 主要試劑與儀器 試劑：人類生物素標記法抗體芯片(RayBio Human Cytokine Antibody Array membranes)，美國RayBiotech公司，貨號：AAH-BLG-1-4，內(nèi)含標記試劑、內(nèi)參、封閉液、洗滌液Ⅰ、洗滌液Ⅱ、熒光染料等。主要儀器：電子天平(北京市測維光電儀器廠)，低溫高速離心機(美國Sigma-Aldrich公司)，超凈工作臺，微量移液器(德國Eppendoff公司)，熒光掃描儀[美國Maxwell Sensors Inc.(MSI.)公司，便攜式FS-Scanner]。

1.3.2 試驗方法 清晨空腹采血，離心機分離血清，取血漿后，應用1×磷酸鹽緩沖液(PBS)(即10 mmol PBS)(pH=8)將血漿稀釋5倍(按20 μL血漿∶80 μL PBS比例稀釋)，取200 μL稀釋后的血漿裝入透析管，并用1×PBS(pH=8)500 mL 4 ℃透析，更換1×PBS再次透析。每次至少3 h，輕微震蕩。應用生物素標記樣本：加40 μL內(nèi)參至裝有35 μL透析過的血漿樣本中。將標記試劑加至血漿樣本管中，立即混勻，室溫孵育30 min，輕輕震蕩，加3 μL終止液至上血漿樣本管中，迅速進行透析。樣本透析后10 000 g離心力4 ℃離心5 min，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｐ酒忾]及孵育：芯片的每個子陣中加入400 μL封閉液，室溫孵育30 min，避免產(chǎn)生氣泡。去除每個子陣中的封閉液，加400 μL上述標記樣品，室溫孵育2 h或4 ℃過夜，輕輕震蕩。去除溶液，去掉芯片匣子裝置，取出玻璃片基。將芯片放入30 mL離心管中，加30 mL 1×洗滌液Ⅰ，震蕩10 min，去除洗滌液，再重復2次。30 mL 1×洗滌液Ⅱ洗滌芯片，2次，每次5 min。最后用30 mL蒸餾水洗滌5 min。然后將芯片放入30 mL離心管中，1 000 r/min離心3 min，使片基干燥或避光放置自然干燥，確保檢測前片基干燥。熒光掃描儀，Cy3通道檢測。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SAM軟件分析，總體比較正常對照組、腎陽虛證組的蛋白質(zhì)表達譜。差異表達靶蛋白的篩選條件：︱Score(d)︱控制在2倍以上(d代表差值，即difference)，同時差異倍數(shù)即Foldchange為2倍以上，則代表該蛋白屬于差異表達。

2 結 果

芯片掃描分析結果 通過對2組芯片中靶蛋白的比值發(fā)現(xiàn)，2組間存在表達上調(diào)的差異蛋白共14條。經(jīng)檢索互聯(lián)網(wǎng)生物學公共數(shù)據(jù)庫，獲得每條差異蛋白的名稱和其他基本信息，見表2。

表2 2組差異表達蛋白的名稱及基本信息

注：“↑”表示表達上調(diào)

3 討 論

人類生物素標記法抗體芯片有靈敏度高、特異性高和準確性高的特點，可以同時檢測507種靶蛋白的表達水平，包括趨化因子、細胞因子、生長因子、蛋白酶、可溶性受體、可溶性黏附分子等。本研究對腎陽虛證蛋白質(zhì)芯片的檢測共發(fā)現(xiàn)14條表達上調(diào)的蛋白，主要涉及生長發(fā)育生殖能力、免疫應答及細胞凋亡等方面。其與中醫(yī)腎陽虛證所表現(xiàn)的腰膝痠痛、耳鳴、性欲減退、發(fā)脫齒松等癥狀相符。

3.1 與生長發(fā)育生殖相關 中醫(yī)學認為，腎藏先天之精，主生長發(fā)育、生殖，腎精化為腎氣，對機體有溫煦、激發(fā)、興奮和制約陰寒等作用者稱為腎陽。腎陽為一身陽氣之根本，能促進精血津液的化生，并使之轉(zhuǎn)化為能量，促進臟腑組織器官功能活動，是人體生命活動力的源泉。腎陽虛損，溫煦失職，命門火衰，不能蒸化腎陰化生精氣，則導致虛寒衰弱諸癥，表現(xiàn)為性欲減退，男子陽萎早泄、女子不孕等。本研究結果顯示，一些與生長發(fā)育生殖相關的靶蛋白，如Src蛋白酪氨酸激酶(Csk)、卷曲蛋白1和4(FZD-1，F(xiàn)ZD-4)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、激活素A受體ⅡA型(ActRⅡA)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-5(BMP-5)、成纖維細胞生長因子樣受體1(FGFRL1)、潛在轉(zhuǎn)化生長因子β結合蛋白1(LTBP-1)等表達異常。

Csk是非受體酪氨酸激酶的一個亞群，是調(diào)節(jié)酪氨酸磷酸化及細胞生長、分化的必需酶[8]。Wnt信號系統(tǒng)參與了胚胎背腹軸的形成、細胞極性建立、細胞命運決定等多個發(fā)育事件，在動物發(fā)育過程中起關鍵作用[9]。Wnt通過其受體，即卷曲蛋白(FZD)實現(xiàn)對組織細胞的調(diào)控。

BDNF在人類神經(jīng)系統(tǒng)、卵巢中表達，其表達隨著生殖細胞的發(fā)育而發(fā)生變化[10]。ActRⅡA屬于TGF-β超家族相關信號蛋白。激活素A在細胞增殖、凋亡過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，可能參與胚胎植入、血管新生等過程[11]。在生殖腺中，激活素A可促進卵泡刺激素的分泌，并協(xié)同卵泡刺激素促進顆粒膜細胞分化；可抑制生長激素分泌，促進人胎盤黃體生成素釋放激素和孕酮的分泌等；另外激活素A還可以促進精原細胞增殖，在精子形成初期有重要的作用。BMP-5在胚胎肢體發(fā)生及關節(jié)形成方面有重要作用，是骨、軟骨組織修復的必要成分[12]。FGFRL1是成纖維細胞生長因子受體家族的新成員，可促進細胞間黏附[13]。LTBP-1是細胞外微纖維蛋白家族成員，與TGF-β結合后可調(diào)節(jié)TGF-β的分泌及激活，影響其在骨和結締組織中的功能[14]。

3.2 與免疫系統(tǒng)相關 腎陽虛證與免疫系統(tǒng)的關系也是備受關注的研究熱點。中醫(yī)學認為，“正氣存內(nèi)，邪不可干”，“邪之所湊，其氣必虛”。腎為先天之本，十二經(jīng)之根，腎陽主導一身之陽氣，腎陽火衰，則諸癥迭出。機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定是機體免疫功能正常的重要因素。現(xiàn)代中醫(yī)研究顯示，腎陽虛存在下丘腦—垂體—腎上腺皮質(zhì)軸不同環(huán)節(jié)不同程度的功能紊亂，導致機體內(nèi)環(huán)境失衡，故免疫功能紊亂，疾病內(nèi)生。本研究結果也證實，腎陽虛證者存在免疫調(diào)節(jié)紊亂，表現(xiàn)為CXC趨化因子受體3(CXCR3)、脂多糖結合蛋白(LBP)、白細胞介素27受體α(IL-27Rα)、白細胞介素13受體Ⅱα(IL-13Rα2)、血小板內(nèi)皮細胞黏附分子1(PECAM-1)、集落刺激因子-1(CSF-1)、ActRⅡA。

CXCR3是干擾素誘導的T細胞α亞族趨化因子(I-TAC)的受體，主要分布在Th1細胞和B細胞。I-TAC是T細胞最重要的趨化劑，對活化、未活化的T細胞均有趨化作用。急性期LBP具有致炎和抗炎的雙重作用，既可加速脂多糖與其受體結合，放大其致炎作用，也可加速脂多糖與清除受體結合，使其被靶細胞清除[15]。IL-27Rα主要分布在外周淋巴細胞、胸腺、脾和淋巴結中[16]，具有誘導Th1反應促炎性作用和減輕炎性反應的雙重免疫調(diào)節(jié)作用，但機制尚未完全明確。IL-13是由不同T細胞亞群和樹突狀細胞產(chǎn)生的細胞因子，主要由激活的輔助T淋巴細胞分泌[17]。IL-13Rα2在被炎癥和細胞因子誘導后，可在脾、腦、肝、肺和胸腺組織中表達。

PECAM-1屬于免疫球蛋白超家族成員[18]，其在炎癥過程中通過調(diào)節(jié)與細胞遷移有關的整合素功能來誘導炎癥起始期，介導細胞遷移；還可引起白細胞外滲，促進白細胞遷移。CSF-1可促進單核細胞數(shù)量的增加、吞噬功能及對細胞毒作用。激活素A作用于單核細胞，有拮抗IL-6、抑制IL-1等作用，參與機體急性期反應調(diào)節(jié)、炎癥損傷及修復。

綜上所述，腎陽虛證者與生長發(fā)育生殖相關的蛋白出現(xiàn)異常，與腎陽虛證有性欲減退，男子陽萎早泄、女子宮寒不孕等表現(xiàn)相符。腎陽虛證者存在明顯的免疫功能紊亂，易感外邪，病后纏綿難愈，與多個蛋白表達異常相關。

[1] 魏敏.腎陰虛證和腎陽虛證基因表達譜的比較研究[D].廣州：南方醫(yī)科大學，2009.

[2] 畢建璐.腎陽虛證和腎陰虛證血漿蛋白表達譜的比較研究[D].廣州：南方醫(yī)科大學，2011.

[3] 許嗣立，李煒弘，賈波，等.老齡腎陽虛證體質(zhì)差異表達基因篩選及半定量RT-PCR驗證研究[J].中華中醫(yī)藥雜志，2014，29(5)：1568-1572.

[4] 呂銀娟，張智華，熊斌，等.腎陽虛對實驗大鼠胃竇粘膜組織凋亡及凋亡相關基因的影響[J].時珍國醫(yī)國藥，2015，26(1)：243-245.

[5] 許嗣立，崔珈銘，李煒弘，等.右歸丸調(diào)控老齡腎陽虛免疫相關基因表達水平的研究[J].中華中醫(yī)藥學刊，2016，34(7)：1609-1612.

[6] 李生強，謝冰穎，謝麗華，等.原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥腎陽虛證骨組織全基因表達譜研究[C]//第十五屆國際骨質(zhì)疏松研討會暨第十三屆國際骨礦研究學術會議會議文集.北京：中國老年學學會骨質(zhì)疏松委員會和中國骨質(zhì)疏松雜志社，2015：76-77.

[7] 沈自尹，王文健.中醫(yī)虛證辨證參考標準[J].中西醫(yī)結合雜志，1986，(10)：598.

[8] Li J，Li Y，He H，et al.Csk/Src/EGFR signaling regulates migration of myofibroblasts and alveolarization[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2016,310(6)：L562-L571.

[9] Mandal A，Holowiecki A，Song YC，et al.Wnt signaling balances specification of the cardiac and pharyngeal muscle fields[J].Mech Dev，2017，143(1)：32-41.

[10] CoriaLucero CD，Golini RS，Ponce IT，et al.Rhythmic Bdnf And Trkb Expression Patterns In The Prefrontal Cortex Are Lost In Aged Rats[J]. Brain Res，2016，15(12)：51-58.

[11] Seki T，Yun J，Oh SP.Arterial endothelium-specific activin receptor-like kinase 1 expression suggests its role in arterialization and vascular remodeling[J].Circ Res，2003，93(7)：682-689.

[12] Garcia EV，Miceli DC，Rizo G，et al. Effect of early addition of bone morphogenetic protein 5 (BMP5) to embryo culture medium on in vitro development and expression of developmentally important genes in bovine preimplantation embryos[J].Theriogenology，2015，84(4)：589-599.

[13] Yang X，Steinberg F，Zhuang L，et al.Receptor FGFRL1 does not promote cell proliferation but induces cell adhesion[J].Int J Mol Med，2016,38(1)：30-38.

[14] Robertson IB，Handford PA，Redfield C.Backbone1H, BC and15N resonance assignment of the C-terminal EGF-cbEGF pair of LTBP1 and flanking residues[J].Biomol NMR Assign，2014，8(1)：159-163.

[15] Ryu JK，Kim SJ，Rah SH，et al.Reconstruction of LPS Transfer Cascade Reveals Structural Determinants within LBP, CD14, and TLR4-MD2 for Efficient LPS Recognition and Transfer[J].Immunity，2017，46(1)：38-50.

[16] de Almeida ND，Demoor T，Ptaschinski C，et al.IL-27R-mediated regulation of IL-17 controls the development of respiratory syncytial virus-associated pathogenesis[J].Am J Pathol，2014，184(6)：1807-1818.

[17] Takenouchi M，Hirai S，Sakuragi N，et al.Epigenetic modulation enhances the therapeutic effect of anti-IL-13R(alpha)2 antibody in human mesothelioma xenografts[J].Clin Cancer Res，2011，17(9)：2819-2829.

[18] Feng YM，Chen XH，Zhang X.Roles of PECAM-1 in cell function and disease progression[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci，2016，20(19)：4082-4088.

(本文編輯：曹志娟)

Study on plasma protein expression profile in syndrome of kidney - yang deficiency

BIJianlu*,WEIMin,SUNXiaomin,etal.

*DepartmentofEndocrinologyandNephrology,SecondHospitalofTraditionalChineseMedicineinGuangdongProvince,Guangdong,Guangzhou510095

Objective To observe the changes of plasma protein expression profile in syndrome of kidney - yang deficiency, to provide evidences for objective study of kidney-yang deficiency syndrome. Methods 5 subjects with kidney-yang deficiency syndrome and 6 healthy subjects were selected in our study. The differences of plasma protein expression profile were analyzed by antibody chip. Results There were 14 up-regulation protein bands between two groups. Among them, the Src protein tyrosine kinase (Csk), Frizzled 1 and 4 (FZD - 1, FZD - 4), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), activin A receptor type Ⅱ A (ActR Ⅱ A), bone morphogenetic protein 5 (BMP - 5), latent TGF-beta binding protein 1(LTBP - 1) and fibroblast growth factor receptor-like 1 (FGFRL1) were related to growth and development. And the CXC chemokine receptor 3 (CXCR3), interleukin 27 receptor alpha (IL - 27Rα) and lipopolysaccharide binding protein (LBP), interleukin 13Ⅱalpha receptors (IL - 13Rα2), colony stimulating factor 1 (CSF - 1), platelet-endothelial cell adhesion molecule (PECAM - 1) and ActR ⅡA were related to immune system. Conclusion The changes of plasma protein expression profile in syndrome of kidney - yang deficiency involve reproduction ability, immune response, cell apoptosis, etc. The results were correspond with the kidney-yang deficiency syndromes, such as lumbar debility, tinnitus and deafness, hair off and tooth loose, sexual hypoactivity and so on.

Kidney-yang deficiency; Protein expression profile; Embryonic development; Immunity

10.3969/j.issn.1002-2619.2017.03.006

※ 項目來源：國家自然科學基金項目(編號：81573812)；國家自然科學基金項目(編號：81603520)；國家自然科學基金項目(編號：81673960);廣東省科學技術廳省級科技計劃項目(編號：2014A020221073)；廣東省高等學校優(yōu)秀青年教師培養(yǎng)計劃項目(編號：YQ2015035)；廣州市科技計劃項目(編號：201607010224)；廣州市科技和信息化局廣州市財政局2014年產(chǎn)學研專項項目(編號：2014Y2-00504)

畢建璐(1984—)，女，主治醫(yī)師，博士。從事內(nèi)分泌腎病科臨床診療工作。研究方向：亞健康與腎病。

R241.6；R2-03；R349.84

A

1002-2619(2017)03-0343-05

2017-01-15)

△ 通訊作者：南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，廣東 廣州 510515

1 福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院，福建 福州 350122

2 南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，廣東 廣州 510515

3 暨南大學醫(yī)學院，廣東 廣州 510632