稀釋液中添加L—半胱氨酸對雞精液室溫保存的影響

趙萬樂 李艷玲++朱松波 陳二平 +張兆旺

摘要：利用安卡紅種公雞新鮮精液，在A、B等2種稀釋液稀釋后分別添加不同濃度的L-半胱氨酸，測定精子活率和精子畸形率，比較不同濃度的半胱氨酸對雞精液在常溫保存下的效果。結果表明，在常溫下保存，在A稀釋液中添加1.0 mmol/L L-半胱氨酸的雞精液的各項指標值均比不添加和添加5.0 mmol/L L-半胱氨酸的好（P<0.05），且保存效果較為理想。在B稀釋液中添加1.0、5.0 mmol/L L-半胱氨酸的精子有效存活時間極顯著高于對照組（P<001）；隨著L-半胱氨酸添加量的增多，生存指數值變大，且以添加5.0mmol/L L-半胱氨酸最高，但與添加 1.0 mmol/L L-半胱氨酸間差異不顯著（P>0.05）。但是，2種稀釋液中是否添加L-半胱氨酸對精子畸形率影響不大（P>0.05）。

關鍵詞：稀釋液；雞；精液；L-半胱氨酸；室溫保存；精子活率；畸形率

中圖分類號： S831.3+2文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）03-0131-03

收稿日期：2015-12-25

作者簡介：趙萬樂（1987—），男，山西晉城人，碩士，研究實習員，主要從事動物繁殖技術方面的研究。E-mail：503587578@qq.com。

[JP2]精液保存會隨著時間的推移而使精子活力以及受精能力降低[1]，即使是使用一些比較好的稀釋液。精子在呼吸代謝過程中能產生活性氧族（ROS），攜帶有氧自由基，造成過氧化損傷，這是受精能力下降的重要原因之一。因此，在精液稀釋液中添加抵抗自由基的成分是很有必要的[2]。近些年，過氧化作用對精子的不良影響得到研究者的普遍重視，[JP]但是由于物種和抗氧化劑作用機理的不同，抗氧化劑在精液保存中的添加量和作用效果報道不盡相同。本試驗根據雞精液的氧化原理和L-半胱氨酸的作用機理，在稀釋液中添加不同濃度的L-半胱氨酸，觀察精液在常溫下的保存效果，現報道如下。[JP]

1材料與方法

1.1試驗動物

選用15羽健康、繁殖性能好的安卡紅種公雞，供采精用。供試驗雞的飼料配方見表1。

1.2試驗方法

1.2.1稀釋液配方根據試驗目的配制2種基礎稀釋液A、B（表2）各250 mL，然后各取3份，均為30 mL，編號為A0、A1、A2，B0、B1、B2，以A0、B0為空白對照組，然后在控制A、B稀釋液滲透壓和pH值基本不變的基礎上分別向其中添加不同濃度的L-半胱氨酸，制成A1、A2、B1、B2等4種稀釋液，其中A1、B1中1.0 mmol/L L-半胱氨酸添加量為 3.6 mg，A2、B2中5.0 mmol/L L-半胱氨酸添加量為 18.2 mg。

1.2.2精液采集用腹背部聯合按摩法采集公雞精液，將采得的雞精液用紗布過濾，注意在采集過程中減少糞便、血液、尿酸鹽等的污染。然后將集精瓶用毛巾包好迅速帶回實驗室，運送過程中，且盡量避免振蕩。

1.2.3精液的稀釋和保存分別用稀釋液A0、A1、A2、B0、B1、B2在室溫下將雞精液按照體積比1 ∶[KG-*3]3進行稀釋，稀釋后迅速檢查精子活率，然后置于室溫（試驗進行期間最高室溫27 ℃，最低室溫24.5 ℃）下進行保存。測定精子生存指數和總存活時間，即每隔4 h觀察1次活率，直到精子的活率為0時終止，每個處理重復4次。精子生存指數為相鄰2次精子活率平均數與間隔時間乘積的總和，總存活時間為從觀察開始至精子活率為0時的累計時間和。此外，本試驗結合生產實際情況測定有效生存指數和有效存活時間，即指精子的活率為0.6時的生存指數和精液保存時間。

1.2.4精子畸形率精子畸形率是通過用龍膽紫染液染色后的精液抹片在顯微鏡1 000倍油鏡下觀察300個精子中畸形精子所占的比例。分2次觀察，第1次為在剛稀釋完后即行抹片觀察，第2次為等精子全部死亡時。

1.3數據處理

利用Excel 2007對原始數據作初步整理，然后采用SPSS 170生物統計軟件包進行統計學分析，差異顯著標準為P<0.05。[JP]

2結果與分析

2.1生存指數和總存活時間

試驗結果（表3）表明，在添加相同濃度L-半胱氨酸的情況下，用B 稀釋液保存雞精液的精子總存活時間和生存指數均顯著高于A稀釋液（P<0.05）。就某一個稀釋液而言，在A中添加1.0 mmol/L L-半胱氨酸時，生存指數均顯著高于不添加和添加5.0 mmol/L L-半胱氨酸等2個試驗組（P<0.05），但總存活時間以添加5.0 mmol/L L-半胱氨酸最長，且顯著長于對照組和添加1.0 mmol/L L-半胱氨酸試驗組（P<0.05）。而在B液中添加1.0、5.0 mmol/L L-半胱氨酸的生存指數顯著高于未添加組，且以添加5.0 mmol/L L-半胱氨酸的效果最好（P<0.05），總存活時間表現出與A 稀釋液相同的趨勢。

2.2有效生存指數和有效存活時間

試驗結果（表4）表明，添加相同濃度半胱氨酸的情況下，用B稀釋液保存雞精液的精子有效存活時間和有效生存指數均顯著高于A稀釋液（P<0.05）。在A稀釋液中添加10、5.0 mmol/L 半胱氨酸時，有效生存指數均顯著高于對照組（P<0.05），但2組間無顯著差異（P>0.05）；有效顯存活時間以添加1.0 mmol/L最長，且顯著的高于其他2組（P<005）。而在B稀釋液中無論是否添加L-半胱氨酸，其有效生存指數差異不顯著（P>0.05），但對于有效存活時間來說，添加1.0、5.0 mmol/L均顯著高于未添加組（P<0.05）。

2.3保存前后2個時期精子畸形率

本試驗將巨型精子、短頭精子、雙頭或雙尾精子、頂體膨脹或脫離、精子頭部殘缺或尾部分離等各種精子異常類型均視為畸形，試驗結果（表5）表明，添加相同濃度L-半胱氨酸的情況下，第1次觀察用B 稀釋液保存的雞精液時，其精子畸[CM（25]形率顯著低于A稀釋液（P<0.05），而第2次兩者之間差異不顯著（P>0.05）。同一種稀釋液而言，2種稀釋液在不添加L-半胱氨酸和添加1 mmol/L L-半胱氨酸時精子畸形率差異均不顯著（P>0.05），第1次觀察時A、B等2種稀釋液在不添加L-半胱氨酸和添加1 mmol/L L-半胱氨酸時精子畸形率顯著低于添加5 mmol/L L-半胱氨酸時的精子畸形率（P<0.05）；第2次觀察時，A稀釋液精子畸形率差異均不顯著（P>0.05），B稀釋液在不添加L-半胱氨酸和添加 1 mmol/L L-半胱氨酸時精子畸形率顯著低于添加5 mmol/LL-半胱氨酸精子畸形率（P<0.05）。

3結論與討論

從表3、表4可看出，總的趨勢是添加組的保存效果好于未添加組，且添加量或稀釋液不同，試驗結果也不同。在A稀釋液中，生存指數以添加1.0 mmol/L時最高，2個試驗組間的有效生存指數無顯著差異，但顯著高于對照組。說明在精液保存前期（精子活率將至60%以前）L-半胱氨酸濃度對精子機能影響不大，后期會有較大影響，在B稀釋液中也表現出類似結果。造成這一結果的具體原因還不清楚，須進一步研究。精子的存活時間和稀釋液的氧化還原指數相關，精子在氧化還原指數為0，即在高度無氧的保護液中保存時間最長；在純氧環境中，精子幾乎不能生存，抗游離氧自由基能力很弱。另外，生物氧化、輻射、污染物侵害、細胞內酶促反應等過程中釋放的自由基對生物分子，尤其是對脂質和核酸有很大的損傷作用，但保護性酶和抗氧化劑可防止自由基的損害作用[3]。所以，在稀釋液中添加含巰基抗氧化劑的一個主要目的就是能夠及時清除精子代謝和外界因素產生的自由基，以達到對精子的保護作用。L-半胱氨酸是一種含有巰基的小分子量氨基酸，是細胞間谷胱甘肽（GSH）的前體，極易滲入細胞膜，增強細胞內和細胞外GSH的生物合成，進而清除了自由基而保護了膜內的脂類和蛋白質。精子在常溫保存過程中會進行緩慢的呼吸代謝活動而產生活性氧族，所攜帶的氧自由基氧化性很強，能氧化精子質膜的不飽和脂肪酸，干擾精子的代謝，造成過氧化損傷，這就是精子受精能力下降的重要原因[4]。Ravie等報道，雞和火雞精子中含有多不飽和脂肪酰基[5]，而且雞和火雞精子的體外保存都起過氧化反應、精子脂質過氧化反應，對精子具有中毒效應[6-7]。Fujihara 等試驗發現，脂質過氧化反應會降低精子活率[8]。從對火雞精子的研究來看，精子中的抗氧化性沒有足夠高，因此不能夠抑制精子脂質過氧化反應，這可以解釋本試驗中添加L-半胱氨酸后精液的保存效果明顯好于不添組。

本試驗雖未得出對于A、B等2種稀釋液添加L-半胱氨酸的準確量，但隨著L-半胱氨酸濃度的增加，保存效果開始變得不明顯，但在不同的稀釋液中這種變化不同，具體來說，在A 稀釋液中添加5 mmol/L L-半胱氨酸時，除總存活時間外其他3個指標均有所下降；B稀釋液在同等情況下雖有所上升，但不明顯，說明抗氧化劑的添加量只有在合適的濃度下才能發揮效果。Blesbois等試驗證明，維生素C濃度低時才具有抗氧化作用，而高濃度的維生素C具有促氧化作用[9]。孫琪證明，在向稀釋液中添加2、4 mmol/L 半胱氨酸均能提高豬精子各項指標，更可以維持8 d 60%以上的活率，其中2 mmol/L 半胱氨酸效果更顯著，添加8 mmol/L 半胱氨酸效果則較為不明顯[10]。覃永長等證明，在250 mL基礎稀釋液中添加0.1 g（在本試驗中相當于3.3 mmol/L）L-半胱氨酸保存豬精液8 d時，精子活率還保持在50%以上[11]。李大吉等在冷凍稀釋液中添加1 mmol/L N-乙酰半胱氨酸+0.1 mg/mL L-半胱氨酸（在本試驗中相當于1.0 mmol/L），解凍后豬精子的平均路徑速度、平均側擺幅度和平均鞭打頻率最高，運動的線速度最低，但對膜脂質過氧化反應沒有影響，但 0.1 mg/mL L-半胱氨酸處理組可以明顯降低丙二醛（MDA）含量[12]。雖然有很多試驗已經證明L-半胱氨酸可以有效地保護精子，降低精子畸形率，但在本試驗中可以看出，是否添加L-半胱氨酸對精子畸形率似乎并沒有多大的改變，這可能是由試驗條件造成的，精液來源于不同物種以及稀釋液溶質。

本試驗通過測定雞精液保存過程中精子的生存指數及有效存活時間可知，在A稀釋液中添加1.0 mmol/L L-半胱氨酸效果較好，但添加5.0 mmol/L L-半胱氨酸時保存效果會有所下降；在B稀釋液中添加 1.0 mmol/L L-半胱氨酸與添加5.0 mmol/L L-半胱氨酸的保存效果差異不顯著，但均高于空白對照組，這種差異可能是由稀釋液的不同造成的。綜上可知，在本試驗中影響精子體外存活時間和有效存活時間的因素不是某一個因素造成的，B稀釋液比A稀釋液好，可能是由于B稀釋液中某些成分和L-半胱氨酸共同作用才表現出對雞精液的體外保存效果，可能是增加了抗氧化劑的作用，但具體機制還須要進一步分析。在進行雞精液體外常溫保存時，添加L-半胱氨酸可以明顯延長保存時間，但不同濃度保存效果不相同。

[HS2]參考文獻：[HJ1.7mm]

[1]Yoshida M. Conservation of sperms：current status and new trends[J]. Animal Reproduction Science，2000，60/61（3）：349-355.

[2]高飛，岳奎忠，楊增明. 豬精液液態保存的研究進展[J]. 中國畜牧雜志，2004，40（6）：46-49.

[3]Rodriguez-Martinez H，Saravia F，Wallgren M，et al. Boar spermatozoa in the oviduct[J]. Theriogenology，2005，63（2）：514-535.

[4]張長興，陳理盾. 影響豬精液保存時間的因素[J]. 河南畜牧獸醫，2001，28（8）：15-16.

[5]Ravie O，Lake P E，The phospholipids～bound fatty acids of fowl and turkey spermatozoa[J]. Anim Reprod Sci，1984，9（2）：189-192.

[6]Fujihara N，Koga O. Prevention of the production of lipid peroxide in rooster spermatozoa[J]Anim Reprod Sci，1984，7（4）：385-390

[7]Cecil H C，Bakst M R. In vitro lipid peroxidation of Turkey spermatozoa[J]. Poultry Sci，1993，72（7）：1370-1378.

[8]Fujihara N，Howarth Jr B.Lipid peroxidation in lowi spermatozoa[J]. Poultry Sci，1978，57（6）：1766-1768.

[9]Blesboid E，Grasseau I，Blum J C. Effects of vitamin E on fowl semenstorageat 4C[J]. Theriogenology 1993，39（3）：771-779.

[10]孫琪.不同抗氧化劑對豬精液常溫保存的影響[D]. 哈爾濱：東北農業大學，2009.

[11]覃永長，張家慶，朱旋，等. 不同類型半胱氨酸對豬精液保存的影響[J]. 養豬，2010（2）：20-22.

[12]李大吉，魏世寶，金一，等. N-乙酰半胱氨酸和L-半胱氨酸對凍融后豬精液品質的影響[J]. 畜牧與獸醫，2009，41（9）：42-44.