HPLC同時測定盆炎凈膠囊中3種有效成分含量

袁志鷹，楊巖濤，李榮東，李哲，歐陽吉德

1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；2.郴州市食品藥品檢驗所，湖南 郴州 423000

HPLC同時測定盆炎凈膠囊中3種有效成分含量

袁志鷹1，楊巖濤1，李榮東1，李哲1，歐陽吉德2

1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；2.郴州市食品藥品檢驗所，湖南 郴州 423000

目的 建立HPLC同時測定盆炎凈膠囊中3種有效成分芍藥苷、原兒茶酸和綠原酸的含量分析方法。方法 采用SHIMADZU VP-ODS-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流動相為乙腈-0.15%磷酸溶液梯度洗脫，檢測波長231、255、326 nm，流速1.0 mL/min，柱溫30℃，進樣量20μL。結果 在上述色譜條件下，芍藥苷、原兒茶酸、綠原酸之間分離度良好。芍藥苷Y＝1546.412 8X＋127.075 6（r＝0.999 9），線性范圍150.054～1254.50 ng；原兒茶酸Y＝2925.846 8X＋2204.107 6（r＝0.999 8），線性范圍162.33～1352.75 ng；綠原酸Y＝893.904 5X－261.731 5（r＝0.999 4），線性范圍11.43～95.25 ng。3種成分的平均回收率分別為97.60%、102.09%、98.52%。結論 該方法操作簡單、方便、準確，可為盆炎凈膠囊的質量控制提供借鑒。

盆炎凈膠囊；芍藥苷；原兒茶酸；綠原酸；高效液相色譜法

盆炎凈膠囊是在盆炎凈顆粒（衛生部藥品標準WS3-B-2387-97）的基礎上改變劑型而成，由忍冬藤、蒲公英、雞血藤、益母草、狗脊、車前草、赤芍、川芎共8味藥組成，具有清熱利濕、和血通絡、調經止帶之功效，適用于濕熱下注、白帶過多等婦科帶下病，是臨床常用中成藥之一，療效確切[1]，且未見明顯不良反應。但現有質量標準（國家食品藥品監督管理局標準YBZ23722005）較為簡單，只有部分藥材的薄層定性鑒別，難以整體控制藥品質量。芍藥苷為赤芍的定量指標成分[2]；君藥忍冬藤和蒲公英具有較強的抗菌作用，其抗菌有效成分以綠原酸為主[3]；原兒茶酸是忍冬藤、雞血藤、狗脊、川芎、車前草等多種藥材中的主要活性成分[4-8]。以上3種成分均具有較強的生理活性。采用HPLC單獨測定芍藥苷[9-10]、原兒茶酸[11]、綠原酸[3]含量的方法均已建立，但尚無同時測定3種成分含量的方法。因此，為全面控制盆炎凈膠囊質量，提高分析檢測效率，本研究嘗試建立同時測定芍藥苷、原兒茶酸、綠原酸3種主要藥效活性物質含量的HPLC方法。

1 儀器與試藥

島津LC-20A型高效液相色譜儀（日本島津公司），島津SPD-M20A二極管陣列DAD檢測器，SIL-20A自動進樣器，METTLER TOLEDO ML204電子分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司），KQ-300DE超聲清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

芍藥苷對照品（批號110736-201539）、原兒茶酸對照品（批號110809-201205）、綠原酸對照品（批號110753-201415），中國食品藥品檢定研究院。盆炎凈膠囊（湖南東潤聯合制藥有限公司，批號分別為20140302、20140415、20151221、20150524、20151213、20141105、20150126）；乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為SHIMADZU VP-ODS-C18（250 mm× 4.6 mm，5μm）；流動相A為乙腈，B為0.15%磷酸溶液，梯度洗脫（見表1）；流速：1.0 mL/min；波長：231、255、326 nm；柱溫：30℃；進樣量：20μL。

表1 流動相梯度洗脫程序

2.2 對照品溶液制備

精密稱定芍藥苷、原兒茶酸和綠原酸對照品適量，置于同一量瓶中，加乙腈溶解稀釋，制成每1 mL含芍藥苷250.90μg、原兒茶酸270.55μg和綠原酸19.05μg的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

取盆炎凈膠囊內容物約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，稱定質量，超聲提取（功率300 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定質量，用50%甲醇補足減失的質量，搖勻，過濾，濾液過微孔濾膜（0.45μm），取續濾液，即得。

2.4 陰性對照溶液制備

忍冬藤、蒲公英、雞血藤、狗脊、車前草、赤芍、川芎中均含有芍藥苷、原兒茶酸和綠原酸3種有效成分中的1種或多種，故按處方配比制成只有益母草（缺忍冬藤、蒲公英、雞血藤、狗脊、車前草、赤芍、川芎）的陰性樣品，按“2.3”項下方法制備，即得。

2.5 專屬性試驗及系統適用性試驗

在“2.1”項色譜條件下，混合對照品與供試品溶液中3種有效成分達到基線分離，色譜圖見圖1。芍藥苷、原兒茶酸、綠原酸各色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均＞1.5，理論塔板數按芍藥苷峰計均＞3000。

圖1 盆炎凈膠囊中芍藥苷、原兒茶酸、綠原酸HPLC圖（λ＝231 nm）

2.6 線性關系考察

精密吸取混合對照品溶液300、500、1000、1500、2000、2500μL，分別置于10 mL量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻。在上述色譜條件下，吸取各濃度混合對照品溶液20μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜峰面積。以峰面積為縱坐標，混合對照品進樣量（ng）為橫坐標，繪制標準曲線，進行線性回歸，得回歸方程：芍藥苷（λ＝231 nm）Y＝1546.412 8X＋127.075 6（r＝0.999 9），線性范圍150.054～1254.50 ng；原兒茶酸（λ＝255 nm）Y＝2925.846 8X＋2204.107 6（r＝0.999 8），線性范圍162.33～1352.75 ng；綠原酸（λ＝326 nm）Y＝893.904 5X－261.731 5（r＝0.999 4），線性范圍11.43～95.25 ng。

2.7 精密度考察

取同一對照品溶液20μL，連續進樣5次，記錄色譜峰峰面積，芍藥苷、原兒茶酸和綠原酸色譜峰峰面積的RSD分別為0.7%、0.4%、0.5%，表明儀器精密度良好。

2.8 重復性試驗

按“2.3”項下方法重復制備5份同一批號的供試品溶液，分別進行測定，記錄色譜峰峰面積，芍藥苷、原兒茶酸和綠原酸色譜峰峰面積的RSD分別為1.5%、1.3%、1.9%。表明本方法重復性良好。

2.9 穩定性試驗

精密吸取同一供試品溶液20μL，在上述色譜條件下，分別在0、2、4、6、12 h進樣測定，記錄色譜峰峰面積，芍藥苷、原兒茶酸和綠原酸色譜峰峰面積的RSD分別為1.3%、1.0%、1.2%。表明3種有效成分在12 h內穩定。

2.10 加樣回收試驗

精密稱取已知含量的盆炎凈膠囊樣品6份（每份內容物0.1 g），精密加入2.0 mL混合對照品溶液（相當于芍藥苷501.80μg、原兒茶酸541.10μg、綠原酸38.10μg），按“2.3”項下方法制備供試品溶液，并按上述色譜條件進行測定，經計算，加樣回收率分別為97.60%、102.09%、98.52%，RSD分別為1.39%、1.53%、1.12%，表明回收率良好。結果見表2。

表2 盆炎凈膠囊中3種成分加樣回收率試驗

2.11 樣品測定

分別精密稱取10份不同批號的盆炎凈膠囊，每份約0.2 g，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，各被測組分與共存組分實現基線分離，采用外標法計算樣品中各成分的含量，結果見表3。

表3 盆炎凈膠囊中各成分含量測定（mg/g）

3 討論

本試驗根據芍藥苷、原兒茶酸和綠原酸的性質，對供試品溶液的制備方法進行了條件篩選。提取溶劑比較了純甲醇、75%甲醇、50%甲醇、95%乙醇、75%乙醇、50%乙醇、水等的提取效果，結果表明，甲醇提取效果比乙醇好，而甲醇3個濃度的提取效果相近，考慮到成本，選定50%甲醇作為提取溶劑；提取方式比較了超聲和回流對提取效果的影響，結果顯示，超聲提取效率優于回流提??；提取時間比較了超聲15、30、60 min對測定結果的影響，結果顯示，超聲提取30、60 min的效果相近，均明顯優于15 min提取效果，綜合能量消耗及生產效率等因素，選定提取時間30 min。因此，最終選擇50%甲醇作為提取溶劑，超聲提取30 min制備供試品溶液。

本試驗對色譜條件進行優選，采用二極管陣列檢測器在波長200～400 nm范圍內掃描，發現芍藥苷在231 nm、原兒茶酸在255 nm、綠原酸在326 nm處有最大吸收，為提高分析方法的靈敏度，減少干擾，本研究采用多波長檢測方法；考察不同色譜柱Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）、Phenomenex Gemini C18（250 mm×4.6 mm，5μm）和SHIMADZUVP-ODS-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）的峰形、柱效和分離度，結果顯示，以SHIMADZU VP-ODS-C18為最佳；試驗比較了乙腈-水、乙腈-0.15%磷酸、甲醇-水、甲醇-0.15%磷酸等不同比例的流動相系統進行梯度洗脫，結果表明，以乙腈-0.15%磷酸為流動相梯度洗脫，基線平穩，供試品各成分峰保留時間適中，分離度和峰形最佳。最終優選色譜條件為：SHIMADZU VP-ODS-C18色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5μm），流動相為乙腈-0.15%磷酸水溶液，梯度洗脫，流速1.0 mL/min，檢測波長分別為231、255、326 nm，柱溫30℃。在此條件下，基線平穩，分離效果好，因此所建立的方法能同時準確測定芍藥苷、原兒茶酸和綠原酸的含量。

對盆炎凈膠囊樣品的測定結果表明，7個批次中均含有芍藥苷、原兒茶酸和綠原酸，其中芍藥苷和原兒茶酸含量比綠原酸高，但不同批次樣品的3種成分含量有一定的差異，可能與藥材及工藝流程有關，需進一步探討。本研究建立了同時測定盆炎凈膠囊中芍藥苷、原兒茶酸和綠原酸含量的分析方法，方法簡單、方便、準確，可為盆炎凈膠囊、盆炎凈顆粒及相關藥材的質量控制提供借鑒。

[1]章慶.盆炎凈膠囊聯合抗生素治療慢性盆腔炎28例臨床觀察[J].中醫藥導報,2011,17(6)：37-38.

[2]謝曉梅,余長柱,徐衡,等.赤芍飲片質量標準研究——芍藥苷的含量測定[J].中國中藥雜志,2004,29(8)：759-762.

[3]陳葉青.RP-HPLC法測定盆炎凈膠囊中綠原酸的含量[J].中國藥師, 2010,13(8)：1205-1206.

[4]張聰,殷志琦,葉文才,等.忍冬藤的化學成分研究[J].中國中藥雜志, 2009,34(23)：3051-3053.

[5]翟明,劉軍民,安冉,等.HPLC法測定雞血藤類藥材中原兒茶酸的含量[J].中藥新藥與臨床藥理,2009,20(5)：462-465.

[6]原忠,余江天,蘇世文.用薄層掃描法測定中藥狗脊和黑狗脊中原兒茶酸及咖啡酸的含量[J].沈陽藥科大學學報,2000,17(5)：338-340.

[7]王文祥,顧明,蔣小崗,等.川芎化學成分研究[J].中草藥,2002,33(1)：4-5.

[8]張振秋.車前草的質量及應用研究[D].沈陽：遼寧中醫學院,2001.

[9]周海嬰,王斯成.HPLC法測定盆炎凈膠囊中芍藥苷的含量[J].中國醫藥導報,2007,4(2)：159-160.

[10]明全忠,董媛,劉春霞.RP-HPLC測定盆炎凈顆粒中芍藥苷的含量[J].中成藥,2006,28(6)：922-923.

[11]朱翔宇,楊蓮菊,李春.HPLC測定五靈脂中原兒茶酸含量[J].中國實驗方劑學雜志,2010,16(6)：71-73.

Simultaneous Contents Determination of Three Active Ingredients in Penyanjing Capsules by HPLC

YUAN Zhi-ying1,YANG Yan-tao1,LI Rong-dong1,LI Zhe1,OUYANG Ji-de2
(1.Hunan University of Chinese Medicine,Changsha 410208,China;2.Chenzhou Institute for Food and Drug Control,Chenzhou 423000, China)

Objective To establish an HPLC method for simultaneous contents determination of paeoniflorin, protocatechuic acid and chlorogenic acid in Penyanjing Capsule.Methods The chromatographic separation was performed on a SHIMADZU VP-ODS-C18 column(4.6 mm×250 mm,5μm);the column temperature was maintained at 30℃;A gradient elution of acetonitrile-0.15%phosphoric acid aqueous solution was adopted at the flow rate of 1.0 mL/min;The UV detection wavelengths were at 231,255,and 326 nm;The injection volume was 20 μL.Results Paeoniflorin,protocatechuic acid and chlorogenic acid could be separated efficiently with this condition. The regression equation was Y=1546.412 8X+127.075 6(r=0.999 9),Y=2925.846 8X+2204.107 6(r=0.999 8), Y=893.904 5X－261.731 5(r=0.999 4),respectively.Paeoniflorin,protocatechuic acid and chlorogenic acid were linear in the range of 150.054–1254.50 ng,162.33–1352.75 ng,11.43–95.25 ng,and the average recoveries were 97.60%,102.09%and 98.52%.Conclusion The method is simple,convenient and accurate,which can be used to the quality control of Penyanjing Capsule.

Penyanjing Capsule;paeoniflorin;protocatechuic acid;chlorogenic acid;HPLC

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.05.019

R284.1

：A

：1005-5304(2017)05-0082-04

2016-06-14）

（

2016-07-14；編輯：陳靜）

湖南省自然科學基金（13JJ5032）；湖南省教育廳優秀青年項目（15B172）；湖南省中醫藥管理局科研項目（201494）；湖南中醫藥大學青年教師科研基金（2015-13）；湖南中醫藥大學中藥技能大學生創新實驗項目（201603）

楊巖濤，E-mail：xdyyt1@163.com