鉤藤中烏索酸和鉤藤堿對肝癌細胞株HepG2的影響

吳計超，祝杰，聶東雷，潘思穎，黃群

1.右江民族醫學院研究生學院，廣西 百色 533000；2.右江民族醫學院附屬醫院，廣西 百色 533000

鉤藤中烏索酸和鉤藤堿對肝癌細胞株HepG2的影響

吳計超1，祝杰1，聶東雷1，潘思穎1，黃群2

1.右江民族醫學院研究生學院，廣西 百色 533000；2.右江民族醫學院附屬醫院，廣西 百色 533000

目的 觀察鉤藤中烏索酸和鉤藤堿對人肝癌細胞株HepG2的影響，探討其抗肝癌的機制。方法 將50、25、12.5、6.25 μmol/L烏索酸、鉤藤堿分別與人肝癌細胞株HepG2共同培養24、48、72 h后，以1%DMSO為陰性對照組，CCK-8法檢測HepG2細胞增殖，吖啶橙熒光染色觀察50 μmol/L烏索酸、鉤藤堿和1%DMSO作用48 h后HepG2細胞形態。結果 烏索酸對HepG2細胞增殖有明顯的抑制作用，并且其抑制率與作用時間、藥物濃度呈正相關，鉤藤堿對HepG2細胞增殖抑制作用較弱。病理觀察結果顯示，鉤藤堿組大部分細胞出現細胞皺縮、包漿致密、核染色邊集等凋亡早期改變，而烏索酸組大部分細胞出現核裂解、凋亡小體等凋亡晚期改變。結論 鉤藤中烏索酸和鉤藤堿對人肝癌細胞株HepG2增殖有抑制作用，能誘導HepG2細胞凋亡。

烏索酸；鉤藤堿；HepG2細胞

流行病學調查顯示，肝癌發病率和死亡率在惡性腫瘤中排名居前[1-2]。肝癌的高死亡率反映出其惡性程度高、預后較差的特點。所以，探索高效的肝癌細胞凋亡誘導劑并研究其作用機制，對提高肝癌的療效具有較重要的意義。鉤藤以茜草科植物帶鉤莖枝入藥，原用于清熱平肝、降血壓等，迄今為止已從該屬分離鑒定出數百種化學成分，其中主要生物堿類包括鉤藤堿，主要三萜類包括烏索酸。鉤藤堿主要作用是降壓，烏索酸主要作用抑制腫瘤增殖[3-4]。許多研究表明，烏索酸可以通過Bax/Bcl-2途徑抑制多種惡性腫瘤增殖，并誘導其凋亡，如胃癌、乳腺癌、肺癌、白血病等[5-8]。也有研究表明，鉤藤堿可上調原癌基因Bax和下調原癌基因Bcl-2的表達，從而誘導血管平滑肌細胞的凋亡[9]。本研究采用CCK-8法和吖啶橙熒光染色法檢測烏索酸和鉤藤堿對人肝癌HepG2細胞增殖及誘導凋亡作用，探討其抗肝癌的機制。

1 實驗材料

1.1 藥物和細胞株

鉤藤堿、烏索酸，大連美侖生物技術有限公司，批號分別為O0804AS、N0827AS。肝癌HepG2細胞株，中南大學細胞生物中心。

1.2 主要試劑及儀器

吖啶橙（AO）、DMSO（北京索萊寶科技有限公司），DMEM高糖培養基、胎牛血清（上海依科賽生物制品有限公司），CCK-8（日本同仁化學研究所）。MK3型酶標儀（Labsystem，芬蘭），CK-18倒置熒光顯微鏡（Olympus，日本）、CO2培養箱（SONY，日本），TDL-50B低速速離心機（上海安亭科學儀器廠），SW-CJ-2FD凈化工作臺（Airtech公司），ME203電子分析天平（Mettler Toledo），DMIL-LED倒置顯微鏡（Leica，德國）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養

將HepG2細胞接種于含10%胎牛血清的DMEM高糖培基中常規培養、傳代及凍存。

2.2 藥物制備

稱取15 mg烏索酸溶于6 mL DMSO，取1 mL置于EP管中，加入84 μL DMSO稀釋混勻。稱取15 mg鉤藤堿溶于6 mL DMSO，取1 mL置于EP管中，加入288 μL DMSO稀釋混勻。分別取各自混勻液200、100、50、25 μL置于8個EP管中，按次序加入0、100、150、175 μL DMSO稀釋混勻。2種成分終濃度分別為50、25、12.5、6.25 μmoL/L，且DMSO濃度＜1%。

2.3 CCK-8法檢測細胞增殖

待肝癌HepG2細胞生長到對數期取出，調整細胞濃度為2×104個/mL，接種到3組96孔板內，每孔100 μL，空白對照組（培養基、CCK-8、1%DMSO）只加100 μL培養基（無肝癌細胞），而后再放回培養箱培養24 h。向每個培養板的8個實驗組（含HepG2細胞、培養基、CCK-8、烏索酸及鉤藤堿）分別加入1 μL上述所配8個EP管不同濃度的烏索酸和鉤藤堿，向陰性對照組（含HepG2細胞、培養基、CCK-8、1%DMSO）加入1 μL DMSO。取3組培養板分別放回培養箱孵育24、48、72 h，再向培養板內加入10 μL CCK-8試劑，再放回培養箱孵育4 h后取出，于酶標儀波長450 nm處測定吸光度（A）值。鉤藤堿和烏索酸每個時段每個濃度設5個平行對照孔，且每次實驗重復3次，計算細胞抑制率[（A陰性對照組－A實驗組）÷（A陰性對照組－A空白對照組）×100%]。

2.4 HepG2細胞吖啶橙熒光染色

取AO 20 mg，溶于5 mL PBS中混勻，取125 μL加入4875 μL中稀釋成100 μg/mLAO溶液待用。將濃度約為1×105個/mL的HepG2肝癌細胞株接種到6孔板內，每孔2 mL。待細胞生長到對數期后，分別向其中加入50 μmoL/L鉤藤堿、50 μmoL/L烏索酸和20 μL DMSO。作用48 h后，吸出培養液，加入2 mL PBS和80 μLAO溶液。作用5 min后取出，熒光顯微鏡下觀察HepG2細胞形態。

3 統計學方法

4 結果

4.1 烏索酸和鉤藤堿對HepG2細胞增殖的影響

陰性對照組HepG2細胞生長活躍，隨時間延長A值逐漸升高，經50 μmol/L烏索酸作用后，隨時間延長A值逐漸下降（P＜0.05）。經25 μmol/L和50 μmol/L烏索酸作用24、48、72 h后及25 μmol/L和50 μmol/L鉤藤堿作用48、72 h后，各給藥組A值與陰性對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。根據A值計算各組抑制率，顯示烏索酸對HepG2肝癌細胞增殖抑制作用明顯，且其抑制率與作用時間、藥物濃度呈正相關。結果見表1、表2。

表1 烏索酸對肝癌HepG2細胞增殖的影響（±s）

表1 烏索酸對肝癌HepG2細胞增殖的影響（±s）

24 h 48 h 72 hF值A值 抑制率/% A值 抑制率/% A值 抑制率/%空白對照組 5 0.442±0.016 0 0.448±0.014 0 0.434±0.015 0陰性對照組 5 1.124±0.034 0 1.412±0.037 0 1.524±0.051 0 125.67烏索酸組 6.25 5 1.122±0.033 0.29 1.402±0.037 0 1.396±0.044 11.74 90.02 12.5 5 1.118±0.035 0.88 1.385±0.037 1.04 1.103±0.038 38.62 93.49 25 5 0.971±0.032 22.43 1.083±0.028 34.14 1.062±0.038 42.39 16.53 50 5 0.883±0.030 35.34 0.841±0.025 59.23 0.706±0.027 70.05 56.35 F值 57.46 299.25 36.91組別濃度/（μmol/L） n

表2 鉤藤堿對肝癌HepG2細胞增殖的影響（±s）

表2 鉤藤堿對肝癌HepG2細胞增殖的影響（±s）

24 h 48 h 72 h組別濃度/（μmol/L） n F值A值 抑制率/% A值 抑制率/% A值 抑制率/%空白對照組 5 0.435±0.015 0 0.450±0.022 0 0.440±0.010 0陰性對照組 5 1.132±0.037 0 1.424±0.048 0 1.513±0.049 0 99.09鉤藤堿組 6.25 5 1.126±0.041 0.86 1.417±0.046 0.71 1.505±0.046 0.74 101.60 12.5 5 1.125±0.030 1.00 1.405±0.041 1.92 1.461±0.042 4.82 108.59 25 5 1.126±0.030 0.85 1.372±0.037 5.26 1.406±0.039 9.93 109.83 50 5 1.124±0.030 1.15 1.345±0.035 7.99 1.351±0.036 15.03 88.64 F值 0.04 3.34 12.74

4.2 病理觀察結果

陰性對照組HepG2肝癌細胞AO染色后，鏡下觀察顯示，細胞核圓且邊界清晰呈深染，細胞質呈均勻彌散綠色熒光；50 μmol/L烏索酸和鉤藤堿作用48 h HepG2肝癌細胞后，熒光顯微鏡下可見細胞邊緣皺縮，體積變小，有些細胞核開始模糊甚至消失，并出現細胞分布不均及成團分布現象。此改變與細胞核碎裂、染色質凝集、包漿芽突并脫落、形成含核碎片的膜包被凋亡小體等凋亡形態改變相符；鉤藤堿組大部分細胞出現細胞皺縮、包漿致密、核染色邊集等凋亡早期改變，而烏索酸組大部分細胞出現核裂解、凋亡小體等凋亡晚期改變。結果見圖1。

圖1 各組肝癌HepG2細胞病理形態（AO熒光染色，×400）

5 討論

研究表明，鉤藤中很多成分都對腫瘤有一定抑制作用，其各自的調節分子機制也不甚相同。趙明宏等[10]研究了鉤藤中鉤藤酸E對人肝癌細胞的作用，表明鉤藤酸E可調節Bax/Bcl-xL比值引起細胞色素C的釋放，進而引起caspase級聯反應導致肝癌細胞的凋亡。在大多數對烏索酸誘導細胞凋亡的研究中，都顯示烏索酸通過Bax/Bcl-2途徑誘導腫瘤細胞凋亡[11-13]；此外，也有一部分研究顯示烏索酸能降低胃癌細胞Mcl-1基因表達，從而增加腫瘤細胞對各種化療藥物的敏感性[14-16]。有學者研究了鉤藤堿對腫瘤的作用，發現鉤藤總堿在逆轉腫瘤細胞耐藥性方面作用較強[17]。周于祿等[18]通過人耐藥肺腺癌A549/DDP細胞研究了異鉤藤堿的逆轉耐藥性作用，結果表明，逆轉強弱與給藥劑量有關，其可能機制是通過增加細胞內抗腫瘤藥物的濃度并減少藥物外排來發揮其逆轉腫瘤細胞耐藥性的作用。戴國華等[9]研究顯示，鉤藤堿能通過調節Bax/Bcl-2比值途徑誘導血管平滑肌細胞凋亡，并且也可以抑制原癌基因c-Fos、c-Myc的表達。

本實驗采用CCK-8法研究了鉤藤中主要成分烏索酸和鉤藤堿對HepG2肝癌細胞的增殖抑制作用，結果顯示，烏索酸和鉤藤堿對HepG2肝癌細胞的增殖均有抑制作用，其作用效果不同。本實驗還采用AO熒光染色法檢測細胞凋亡，結果表明，烏索酸和鉤藤堿均能誘導HepG2肝癌細胞凋亡，但鉤藤堿誘導的大部分細胞出現凋亡早期形態學改變，而烏索酸誘導的大部分細胞出現凋亡晚期形態學改變。2種成分作用效果的差異可能源于其對HepG2肝癌細胞作用機制的不同。

結合本實驗已顯示的烏索酸和鉤藤堿均能誘導肝癌細胞HepG2細胞發生凋亡，推測兩者在誘導肝癌細胞凋亡方面，可能均通過Bax/Bcl-2途徑發揮作用，但本實驗所知其作用效果存在差異，所以兩者對肝癌細胞的作用可能存在不同的分子機制。

綜上所述，本研究表明鉤藤中烏索酸和鉤藤堿對體外人肝癌細胞株HepG2增殖均有一定的抑制作用，其可能的機制是通過誘導肝癌細胞凋亡，兩者作用的效果存在差異，可能源于不同的作用機制。至于烏索酸和鉤藤堿誘導肝癌細胞凋亡的深入分子機制，以及鉤藤對活體肝癌的作用效果，有待后續研究，以便進一步詮釋鉤藤對肝癌的抑制作用及機制，為臨床用藥提供依據。

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Effects of Ursolic Acid and Rhynchophylline in Uncariae Ramulus Cum Uncis on Human Hepatoma HepG2 Cells

WU Ji-chao1,ZHU-Jie1,NIE Dong-lei1,PAN Si-ying1,HUANG Qun2
(1.Graduate School of Youjiang Medical University for Nationalities,Baise 533000,China;2.Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities,Baise 533000,China)

Objective To investigate the effects of ursolic acid and rhynchophylline in Uncariae Ramulus Cum Uncis on human hepatoma HepG2 cells;To discuss its antihepatoma mechanism.Methods Culture the human hepatoma HepG2 cells with 50,25,12.5,6.25 μmol/L ursolic acid,rhynchophylline for 24,48,72 hours respectively. 1%DMSO was set as negative control group.CCK-8 based cytotoxicity assay was used to detect the growth of HepG2.Acridine orange fluorescent staining was used to observe human hepatoma HepG2 cells cultured with 50 μmol/L ursolic acid,rhynchophylline and 1%DMSO for 48 hours were observed.Results Ursolic acid significantly acted as a disincentive to the growth of HepG2 cells,which was in positive correlation with time and concentration.Inhibited effect by rhynchophylline on HepG2 cell proliferation was weaker than ursolic acid.Pathological observation showed that most of the cells in rhynchophylline group showed cell shrinkage,dense pulp coating and nuclear staining edge set,and most of the cells in the ursolic acid group showed apoptosis late changes,such as nuclear cleavage and apoptotic bodies.Conclusion Ursolic acid and rhynchophyllinein Uncariae Ramulus Cum Uncis can inhibit the proliferation of HepG2 cells and can induce apoptosis.

ursolic acid;rhynchophylline;HepG2 cells

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.05.015

R285.5

：A

：1005-5304(2017)05-0063-04

2016-06-09）

（

2016-07-16；編輯：華強）

廣西高等學校重點實驗室科學研究開放課題（2014年）

黃群，E-mail：huangqundao@163.com