木質素降解產物用于漆酶-介質體系的結構理論研究

陶國翔，李愛秀*，劉子泉，張 敏，羅 力

(1.武警后勤學院基礎部藥物設計實驗室，天津 300309；2.武警后勤學院附屬醫院全軍災害應急救援醫學重點實驗室，天津 300162；3.武警后勤學院科研部，天津 300309)

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木質素降解產物用于漆酶-介質體系的結構理論研究

陶國翔1，李愛秀1*，劉子泉2，張 敏3，羅 力1

(1.武警后勤學院基礎部藥物設計實驗室，天津 300309；2.武警后勤學院附屬醫院全軍災害應急救援醫學重點實驗室，天津 300162；3.武警后勤學院科研部，天津 300309)

為從天然產物中尋找廉價、低毒、高效的漆酶新介質，利用分子模型和分子對接技術在分子水平研究木質素降解產物在漆酶-介質體系中與漆酶活性位點的結合模式與反應能力，以探明其結構特征。結果表明，10種木質素降解產物小分子介質酚羥基鄰位取代基可保持與漆酶作用過程中介質構象的穩定，鄰位取代基的給電子能力可增強介質自由基中間體的穩定性，介質酚羥基對位取代基的吸電子性有利于加強與Phe265間的π-π堆積作用，但對位取代基吸電子性過強反而不利于提高介質反應活性及苯氧自由基穩定性。該研究為新介質的發現及介質結構的改造與修飾奠定了理論基礎與研究方向。

木質素降解產物；漆酶；介質；漆酶-介質體系；分子對接；結構特征

漆酶(laccase,EC1.10.3.2)是一種含銅氧化酶，根據其來源主要分為植物漆酶、昆蟲漆酶、細菌漆酶和真菌漆酶。不同來源的漆酶因結構上的差異導致理化性質與功能的不同[1-2]。真菌漆酶與其它來源漆酶相比具有分泌能力強、產量大、氧化電勢高、催化氧化效果好、結構簡單的優勢，在理化性質和結構方面研究最深入。目前，已有超過100種真菌漆酶得到純化，已知66個漆酶晶體結構中真菌漆酶占38個[3-4]，為在分子水平研究介質與漆酶的結合模式和相互作用奠定了基礎。其中，來源于變色栓菌(Trametes versicolor)的漆酶是真菌漆酶中高產優良品種，常作為研究漆酶的首選[5-6]。在蛋白數據庫(PDB)中，變色栓菌漆酶的晶體結構有2種，PDB編號為1KYA和1GYC。1KYA為變色栓菌漆酶與2,5-二甲基苯胺的四聚體復合物，分辨率為2.40 ?；1GYC為無內嵌配體的變色栓菌漆酶，分辨率為1.90 ?。一般分辨率小于2.50 ?的晶體結構在分子模擬中對預測對接位點具有較高的準確度，兩者均滿足條件。含有內嵌配體的漆酶晶體結構有助于確定介質與漆酶的結合位點及介質的活性構象，還可以幫助研究者觀察晶體結構中介質與漆酶活性位點的結合模式，為研究其它介質與漆酶活性位點相互作用機制提供重要參考，在分子對接研究中極大提高了預測介質與漆酶結合模式的可信度。

漆酶通過與底物之間的電子傳遞完成對底物的催化氧化[7]。漆酶的經典底物為酚類和芳香胺類化合物。在漆酶中加入某些小分子可擴寬底物范圍、提高催化效率，這類小分子稱為“介質”。在漆酶-介質體系(laccase-mediatorsystem,LMS)中，介質主要通過減少漆酶與底物之間的空間阻礙和間接提高漆酶氧化電勢來提高電子傳遞效率。有些漆酶因活性空腔較小或活性空腔與底物空間匹配性較差而影響了二者結合，介質可充當漆酶與底物之間電子傳遞的“電子梭”，實現底物與漆酶之間的電子傳遞。漆酶作用介質后，介質可生成具有較高氧化電勢的介質中間體，加快電子傳遞速率，更利于漆酶對底物的催化氧化[8]。目前已知的漆酶介質主要為人工合成化合物，如2,2-聯氨-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)、N-羥基苯并三唑(HBT)、N-羥基乙酰苯胺(NHA)等，它們大多存在毒性或刺激性較強、生產成本高、中間體穩定性較差等問題[9]，因此，尋找天然來源的漆酶介質成為研究熱點[10]。從木質素降解產物中得到的漆酶介質，具有低毒、易獲得、提取成本低、催化效率高等優勢，實現了木質素類可再生能源的高值化利用，已成為研究者關注的重點，為漆酶新介質的發現開辟了一條新的途徑。

木質素是一種三維網狀高分子聚合物，廣泛存在于高等植物細胞中，是自然界中唯一能夠提供可再生芳基化合物的非石油資源，具有極高的潛在應用價值[11]。木質素降解產物的基本結構單元有3種類型，分別為紫丁香基單元、愈創木基單元和對羥苯基單元[12-13]，其在分子結構上的差異主要體現在酚羥基鄰位甲氧基取代基的數目上，如圖1所示。

圖1 木質素降解產物基本結構單元Fig.1 The basic structural units of lignin degradation products

目前，雖已證實多種木質素降解產物可與漆酶構成LMS[14-21]，但木質素降解產物的介導效果有顯著差異。Camarero等[22]和Moldes等[23]首次嘗試將木質素降解產物作為漆酶介質，發現其中的乙酰香草酮、香草酸甲酯、香草醛等能促進漆酶對污染物的催化降解；Camarero等[24]在降解合成染料活性黑的研究中發現，乙酰丁香酮、紫丁香醛和香草醛對活性黑的降解率分別為88%、83%和66%；Rosado等[20]測試了丁香酸甲酯、乙酰丁香酮和紫丁香醛作為漆酶介質降解非酚類木質素的效果，其中丁香酸甲酯作為介質時的降解效果最好，紫丁香醛最差。

為了深入探討介質分子結構差異對LMS催化氧化效果的影響，作者在此選取來自木質素降解產物的10種漆酶介質，通過分子對接技術模擬介質與漆酶的結合模式，探究介質分子結構中酚羥基鄰位和對位取代基對結合模式的影響，以期為新介質的開發奠定理論基礎。

1 實驗

1.1 技術平臺

所有計算均利用分子模擬與分子設計軟件包MOE 2009(molecular operating environment 2009)在計算機上完成。

1.2 漆酶和介質結構

漆酶來自PDB中變色栓菌漆酶與2,5-二甲基苯胺復合物的晶體結構(PDB編號：1KYA)，1KYA中漆酶活性位點由Phe162、Leu164、Asp206、Asn264、Phe265、Phe332、Phe337、Pro391、Gly392、Ala393、Ile455和His458等氨基酸組成[25]。

介質為來源于木質素降解產物的10種小分子介質，分別為紫丁香醛、乙酰丁香酮、紫丁香醇、丁香酸甲酯、香草醛、乙酰香草酮、香草醇、香草酸甲酯、對羥基苯甲醛和對羥基苯甲醇，其結構如圖2所示。

圖2 源于木質素降解產物的介質結構Fig.2 Structures of mediators from lignin degradation products

根據酚羥基鄰位取代基數目的不同(即母核結構不同)將介質分為3組，每組保持母核結構相同、酚羥基對位取代基不同，組一為紫丁香基介質：紫丁香醛、乙酰丁香酮、紫丁香醇、丁香酸甲酯；組二為愈創木基介質：香草醛、乙酰香草酮、香草醇、香草酸甲酯；組三為對羥苯基介質：對羥基苯甲醛、對羥基苯甲醇。探究介質酚羥基鄰位取代基對結合漆酶的影響時，進行組間比較；探究介質酚羥基對位取代基對結合漆酶的影響時，進行組內比較。

1.3 研究方法

1.3.1 漆酶的初始構象

將1KYA復合物晶體結構導入MOE 2009軟件包，刪除其雜原子、溶劑分子、配體等，保留漆酶A鏈，在Amber99力場下[26]，利用Protonate 3D模塊，在pH值5.0、溫度300 K條件下對漆酶加氫加電荷，保存，作為漆酶的初始構象。

1.3.2 介質的初始構象

介質結構使用MOE-Build模塊繪制，之后以1KYA復合物晶體結構中2,5-二甲基苯胺的構象作為模板，利用MOE-Flexible Alignment模塊將介質與2,5-二甲基苯胺疊合，根據疊合打分，選擇疊合較好的構象作為介質對接的初始構象[27]。

1.3.3 分子對接

采用MOE 2009軟件包進行分子對接，在MOE-Dock模塊中，以構成變色栓菌漆酶活性位點的氨基酸Phe162、Leu164、Asp206、Asn264、Phe265、Phe332、Phe337、Pro391、Gly392、Ala393、Ile455和His458為對接位點，設定力場(forcefield)為MMFF94x、放置函數(placement)為Triangle Mather、打分函數1(rescoring 1)為London dG、優化函數(refinement)為Forcefield、打分函數2(rescoring 2)為London dG。對接完成后，選取介質分子和以漆酶活性位點為中心、半徑5 ?范圍內氨基酸殘基，其余部分固定，在MMFF94x力場下進行能量優化[28]。

2 結果與討論

2.1 漆酶-介質空間匹配結果

本研究所選的10種介質均能結合在漆酶活性位點，介質酚羥基均與酸性氨基酸Asp206形成氫鍵，堿性氨基酸His458作為電子受體接受來自底物的電子[10]，介質主體均與Leu164、Phe265、Gly392產生疏水作用；介質酚羥基鄰位有1個甲氧基取代基時，苯環可與Phe265產生π-π堆積作用，主體與Leu164、Phe265、Gly392、Ala393產生疏水作用；介質酚羥基鄰位有2個取代基時，Asn264可與其中1個甲氧基的氧原子產生氫鍵作用，苯環與Phe265產生π-π堆積作用，主體與Leu164、Phe265、Gly392、Ala393、Pro394和Ile455產生疏水作用；介質酚羥基鄰位無取代基時，主體與Phe162、Leu164、Phe265、Gly392產生疏水作用。

以紫丁香醛、香草醛和對羥基苯甲醛分別作為3組介質的代表，與漆酶活性位點結合模式如圖3所示。表1總結了10種介質與漆酶活性位點氨基酸殘基相互作用的情況。

2.2 漆酶-介質能量匹配結果

介質與漆酶相互作用時還需滿足能量匹配原則。MOE 2009軟件包的分子對接模塊中綜合了構象能量、放置函數得分、優化函數得分等因素，以最終得分S來評價對接結果，S值越低表示結合越穩定。表2為各介質與漆酶活性位點的對接得分結果。

從表2可知，介質母核結構和酚羥基對位取代基均會對對接得分產生影響。當介質酚羥基對位取代基相同時，鄰位取代基越多對接得分越低，結合效果越好；當介質酚羥基對位均為吸電子基時，吸電子能力大小為羥甲基<甲酸甲酯基<乙酰基<醛基；當介質酚羥基鄰位取代基數目相同時，對位取代基吸電子能力越弱對接得分越低，結合效果越好。介質酚羥基與Asp206的氫鍵作用也體現了以上特點，酚羥基對位取代基保持一致，鄰位取代基越多氫鍵作用越強，鍵長越短；酚羥基鄰位取代基數目保持一致，對位取代基吸電子能力越弱氫鍵作用越強，鍵長越短。以上對接結果與Rosado等[20]的實驗結果相符。

圖3 介質與漆酶活性位點的結合模式Fig.3 Binding mode of mediator and laccase active site

表1 介質與漆酶活性位點氨基酸殘基的相互作用

Tab.1 Interactions of mediator and amino acid residues at laccase active site

2.3 討論

2.3.1 介質酚羥基鄰位取代基對結合漆酶的影響

介質酚羥基鄰位取代基對結合漆酶的影響主要體現在兩點：第一，穩定介質與漆酶活性位點結合時的構象；第二，提高介質自由基中間體的穩定性。

(1)鄰位取代基對介質構象的影響

對比組一、組二、組三的對接得分結果發現，酚羥基鄰位有2個取代基的紫丁香基介質和有1個取代基的愈創木基介質與漆酶結合情況普遍優于酚羥基鄰位無取代基的對羥苯基介質。即介質酚羥基對位取代基相同時，其鄰位甲氧基取代基越多，介質與漆酶的結合越穩定。鄰位甲氧基取代基越多，介質與漆酶活性位氨基酸殘基作用的數目越多，分子間相互作用力的類型越多。如：介質母核為紫丁香基時，發生相互作用的氨基酸殘基為9個：2個氫鍵作用、1個π-π堆積作用和6個疏水作用；介質母核為愈創木基時，發生相互作用的氨基酸殘基為6個：1個氫鍵作用、1個π-π堆積作用和4個疏水作用；介質母核為對羥苯基時，發生相互作用的氨基酸殘基為6個：1個氫鍵作用和4個疏水作用，無π-π堆積作用。Phe265與介質苯環之間的π-π堆積作用、Asn264與甲氧基的氫鍵作用以及更多的疏水作用可以更好地穩定介質在漆酶活性位點處的構象[29]。

表2 介質與漆酶活性位點對接得分結果及與Asp206氫鍵作用參數

Tab.2 Docking score of mediator and laccase active site and parameters of hydrogen bonding interaction with Asp206

酚羥基鄰位無取代基的對羥苯基介質可與Phe162產生疏水作用，而未發現該氨基酸殘基與紫丁香基介質和愈創木基介質產生相互作用，這是因為，酚羥基鄰位無取代基時，對羥苯基母核介質進入漆酶活性位點空間阻礙較小(圖3)。由表2可以看出，對羥苯基介質與Asp206之間的氫鍵鍵長較短，可更深入漆酶活性位點與Phe162產生疏水作用，但是對羥苯基介質由于鄰位無取代基，無法對介質與漆酶活性位點結合時的構象及介質中間體起到穩定作用，故作為介質的效果不如紫丁香基介質和愈創木基介質。

從能量匹配的角度來看，保持介質酚羥基對位取代基相同，酚羥基鄰位取代基越多，介質與漆酶活性位點對接得分越低，結合效果越好，再次印證介質酚羥基鄰位取代基在與漆酶結合時產生的重要作用。

(2)鄰位取代基對介質自由基中間體穩定性的影響

D′Alfonso等[30]研究介質與漆酶的相互作用時發現，介質失去質子形成苯氧自由基中間體，苯氧自由基再與底物反應，最終降解底物，去除污染物。但是苯氧自由基中間體十分不穩定，在反應過程中會發生聚合、重排等反應。LMS的催化效率與苯氧自由基的穩定性密切相關。當介質酚羥基鄰位有甲氧基(為給電子基團)時，增大了苯氧自由基的電子云密度，提高了苯氧自由基穩定性，從而降低了其發生聚合、重排等反應的幾率。同時，甲氧基中氧原子p軌道孤對電子可與苯氧自由基的單電子占據分子軌道(SOMO)重疊，產生共振作用穩定苯氧自由基。所以，酚羥基鄰位有甲氧基取代時，苯氧自由基在以上2個因素的共同影響下得以保持穩定。

2.3.2 介質酚羥基對位取代基對結合漆酶的影響

酚羥基對位取代基對苯環同時存在誘導效應和共軛效應，兩者共同影響介質與漆酶的反應活性、介質苯環與Phe265的π-π堆積作用強度及介質自由基中間體的穩定性。

(1)對位取代基對反應活性及π-π堆積作用的影響

介質與漆酶相互作用時，介質分子表面電子云密度增大有利于降低介質的氧化電勢，使之更易被漆酶氧化。本研究中，介質的對位取代基對苯環同時存在誘導效應和共軛效應，表現出吸電子作用，使介質分子表面電子云密度減小，不利于介質反應活性的提高，對位取代基的吸電子作用越弱，該不利因素對介質反應活性影響越小。

紫丁香基介質與愈創木基介質均會與漆酶活性位點中的Phe265產生π-π堆積作用。研究發現[31]，在復合物體系中，苯環含有吸電子基時有利于提高π-π堆積作用強度，因此，介質酚羥基對位吸電子取代基有利于提高其與活性位點中Phe265的π-π堆積作用強度，保持構象穩定。

(2)對位取代基對介質自由基中間體穩定性的影響

苯氧自由基中間體極不穩定，所以保持苯氧自由基的穩定是反應順利進行的關鍵。當對位取代基與苯氧自由基之間存在共軛效應時，苯氧自由基的負電荷分布在共軛體系中，從而保持了苯氧自由基的穩定，然而對位取代基同時具有吸電子效應，會降低苯氧自由基的穩定性，最終表現為對位取代基吸電子能力越弱，苯氧自由基穩定性越高。

3 結論

利用分子對接技術探究了10種來自木質素降解產物的介質酚羥基鄰、對位取代基對結合漆酶的影響。介質與漆酶作用過程中，酚羥基鄰位取代基和對位吸電子取代基通過與漆酶活性位點氨基酸殘基發生相互作用，提高介質與漆酶結合構象的穩定性；酚羥基對位取代基暴露在活性位點外，不與活性位點氨基酸殘基發生相互作用，僅影響介質分子表面電子云分布。在酚羥基鄰、對位取代基共同作用下介質分子表面及苯氧自由基電子云密度發生改變，從而影響介質氧化電勢、反應活性及苯氧自由基穩定性。該研究在分子水平闡明了來源于木質素降解產物的介質的結構特征對結合漆酶的影響，為介質結構的合理改造奠定了理論基礎。

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Structural Theory of Lignin Degradation Product Used in Laccase-Mediator System

TAO Guo-xiang1,LI Ai-xiu1*,LIU Zi-quan2,ZHANG Min3,LUO Li1

(1.DrugDesignLaboratoryoftheBasicScienceDepartment,LogisticsUniversityofChinesePeople′sArmedPoliceForce,Tianjin300309,China;2.KeyLaboratoryofDisasterandEmergencyRescueMedicine,AffiliatedHospitalofLogisticsUniversityofChinesePeople′sArmedPoliceForce,Tianjin300162,China;3.ScientificResearchDepartment,LogisticsUniversityofChinesePeople′sArmedPoliceForce,Tianjin300309,China)

Inordertofindnewlaccasemediatorwhichislow-cost,low-toxicityandhigh-efficiencyfromnaturalproducts,usingmolecularmodelandmoleculardockingtechniqueatthemolecularlevel,thebindingmodeandreactivitybetweenlignindegradationproductsandlaccaseactivesitesinlaccase-mediatorsystem(LMS)wereinvestigatedtoverifytheirstructuralfeatures.Resultsshowedthat,theorthosubstitutedphenolichydroxylgroupsoftenkindsoflignindegradationproductmediatorscouldmaintainthestabilityofmediatorconformationduringtheinteractionwithlaccase.Besides,theelectrondonatingabilityoforthosubstitutedgroupscouldimprovethestabilityofradicalintermediate;theelectronwithdrawingabilityofmediator′sparasubstitutedphenolichydroxylgroupscouldstrengthentheπ-πstackinginteractionbetweenbenzenringandPhe265,butthestrongelectronwithdrawingabilityofparasubstitutedgroupsmightbeunfavorabletoimprovethereactivityofmediatorandthestabilityofphenoxyradical.Thisstudyprovidestheoreticalfoundationandresearchdirectionforthediscoveryofnewmediatorandstructuredesignofmediator.

lignindegradationproduct;laccase;mediator;laccase-mediatorsystem;moleculardocking;structuralfeature

天津市衛生局科技基金資助項目(2015KZ123)，武警后勤學院基礎研究項目(WHJ2016025)

2016-12-13

陶國翔(1991-)，男，河北南宮人，碩士研究生，研究方向：計算機輔助藥物設計，E-mail:taoguoxiang91@126.com； 通訊作者：李愛秀，教授，E-mail:liaixiu2006@126.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.04.007

O641 Q814.9

A

1672-5425(2017)04-0028-06

陶國翔，李愛秀，劉子泉，等.木質素降解產物用于漆酶-介質體系的結構理論研究[J].化學與生物工程，2017，34(4)：28-33.