FXR mRNA表達量與肝惡性腫瘤復發轉移關系探討

王崢嶸+龐靜歡+周艷+金劍英+徐永富+郭群依

[摘要] 目的 探討核受體法尼醇（FXR）mRNA表達量與肝惡性腫瘤復發轉移的關系。 方法 選取2013年3月～2016年3月于我院接受手術切除肝癌組織、癌周組織和正常肝組織的46例患者進行研究，依據病理學標準分為高侵襲組（n=21）和低侵襲組（n=25），分析FXR表達與肝惡性腫瘤復發轉移的關系。 結果 FXR mRNA在高侵襲組中表達量顯著高于低侵襲組，在腫瘤組織中表達量顯著低于癌周組織和正常組織，差異有統計學意義（P<0.05）；兩組術后TB、CB和總膽汁酸含量較術前顯著下降，且高侵襲組手術前后TB、CB和總膽汁酸含量均顯著高于低侵襲組，差異有統計學意義（P<0.05）；FXR mRNA表達量與術前TB、CB和總膽汁酸呈顯著正相關（rs=0.455，P=0.038；rs=0.357，P=0.041；rs=0.348，P=0.042）。結論 肝惡性腫瘤復發轉移侵襲性高時，會促進膽汁酸分泌，加劇肝內膽汁淤滯，從而上調FXR mRNA表達量，FXR可能參與抗肝惡性腫瘤復發轉移過程，具體還有待進一步研究證實。

[關鍵詞] 法尼醇X受體；原發性肝癌；腫瘤復發；腫瘤轉移

[中圖分類號] R735.7 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）07-0001-04

[Abstract] Objective To investigate the relationship between the expression of farnesol X receptor （FXR） mRNA expression and the recurrence and metastasis of hepatic malignant tumors. Methods From March 2013 to March 2016， 46 patients who received surgical resection of liver cancer tissues， peritumoral tissues and normal liver tissues were studied. According to the pathological criteria， they were divided into high invasive group（n=21） and low invasive group（n=25）， and the relationship between expression of FXR and recurrence and metastasis of malignant tumors was analyzed. Results The expression level of FXR mRNA in high invasive group was significantly higher than that in low invasive group， and the expression level in tumor tissues was significantly lower than that in peritumoral tissues and normal tissues （P<0.05）； after surgery， the levels of TB， CB and total bile acid were significantly lower than those before surgery， and the levels in high invasive group before and after surgery were significantly higher than those in low invasive group （P<0.05）； the expression level of FXR mRNA was significantly positively correlated with TB， CB and total bile acid before surgery （rs=0.455， P=0.038； rs=0.357， P=0.041； rs=0.348， P=0.042）. Conclusion Recurrence and metastasis of high invasive hepatic malignant tumors can promote the secretion of bile acid， increase intrahepatic cholestasis， and up regulate expression level of FXR mRNA. FXR may participate in the recurrence and metastasis of hepatic malignant tumors， which remains to be further studied.

[Key words] Farnesol X receptor； Primary hepatocellular carcinoma； Tumor recurrence； Tumor metastasis

膽汁淤積為肝癌常見病理癥狀，是肝惡性腫瘤形成的重要環節，患者出現膽汁淤積時，形成的膽汁流以及膽汁代謝障礙會增加膽汁酸等有毒物質潴留，惡化肝細胞和組織損傷，形成膽汁淤積型肝病[1-3]。核受體法尼醇X受體（FXR）參與膽汁代謝過程，可調節機體膽汁酸平衡，此外，Huang等[4]在小鼠模型中研究發現，敲除FXR基因的小鼠全部出現腫瘤，而野生型小鼠則沒有，認為FXR具有促進損傷肝細胞恢復和生長，抵抗肝癌細胞擴散的作用。目前有關FXR在人肝癌復發轉移方面的研究鮮有報道，本研究針對我院45例接受肝癌手術切除的患者，取其切除肝癌組織、癌周組織和正常肝組織進行研究，旨在探究FXR的表達與肝惡性腫瘤復發轉移的關系，為臨床治療提供新的靶點?，F報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年3月～2016年3月于我院接受手術切除肝癌組織、癌周組織和正常肝組織的46例患者進行研究。納入標準：標本均經病理證實為原發性肝癌組織；入選患者均無其他惡性腫瘤；患者均為首次接受根治性肝切除術者，手術治療前后均進行常規實驗室指標檢查。排除標準：合并嚴重心、腦、腎、肺等重要臟器病變者；手術失敗者；因其他非肝炎型病變所致膽汁淤積者；資料不全者；妊娠及哺乳期婦女。本研究患者男37例，女9例，年齡35～75歲，平均（49.51±5.62）歲，其中病理類型為肝細胞癌者36例，膽管細胞癌者8例，混合型肝癌者2例；其中伴有肝硬化者24例，不伴有肝硬化者22例；癌細胞侵襲肝癌門靜脈栓者9例，淋巴結轉移和神經浸潤者3例，肝內轉移者2例，膈肌浸潤者2例。本研究經我院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標本處理和分組 所有患者均行肝癌根治術治療，切除患者肝癌組織、癌周組織和少部分正常肝組織作為標本，所有標本離體后10 min內取材并放置液氮內速凍后于-80℃冰箱保存，用于后期FXR基因檢測。46例患者的肝組織切除標本，根據Silva癌細胞侵襲性標準[5]，把肝組織表現為腫瘤伴多發肝內擴散，和（或）門脈主干癌栓的標本分為高侵襲組（n=21），把肝組織表現為腫瘤病灶局限、肉眼和鏡下檢測均無肝內擴散和門脈浸潤者的標本分為低侵襲組（n=25）。

1.2.2 FXR基因檢測 將預先處理好的存于-80℃冰箱的樣本參照總RNA提取試劑盒（MRC，美國）說明書，用Trizol法提取肝組織樣本RNA；后使用M-MLV反轉錄試劑盒（Promega）將所提RNA反轉成cDNA，放于-20℃冰箱保存；設計擴增FXR基因和內參基因（GADPH）引物和探針（表1），參照熒光定量PCR試劑盒（ThermoFisher）說明書擴FXR和內參基因，總反應體系20 μL，所用cDNA模板1 μL，上下游引物各0.4 μL，探針0.3 μL，每個樣本做三個實驗學重復，使用Liavak的2-△△Ct法[6]分析FXR基因相對表達量。

1.2.3 分析患者一般資料 記錄兩組患者手術前后血清總膽紅素（TB）、結合膽紅素（CB）和總膽汁酸含量，TB、CB和總膽汁酸均取患者手術前后清晨空腹靜脈外周血，離心獲得血清后于全自動生化分析儀上檢測（日立7180型），所有檢測試劑為儀器配套試劑。

1.3 統計學方法

數據采用SAS 19.0軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，比較采用t檢驗；計數資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗；相關性分析采用Pearson法，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組不同切除肝組織中FXR mRNA表達量比較

FXR mRNA在高侵襲組中表達量顯著高于低侵襲組，在腫瘤組織中表達量顯著低于癌周組織和正常組織，差異具有統計學意義（P<0.05）。見表2。

注：與組內癌周組織和正常組織比較，*P<0.05；高侵襲組：t腫瘤組織/癌周組織=5.56，P腫瘤組織/癌周組織<0.01；t腫瘤組織/正常組織=5.72，P腫瘤組織/癌正常組織<0.01；t癌周組織/正常組織=0.78，P癌周組織/癌正常組織>0.05；低侵襲組：t腫瘤組織/癌周組織=5.38，P腫瘤組織/癌周組織<0.01；t腫瘤組織/正常組織=5.58，P腫瘤組織/癌正常組織<0.01；t癌周組織/正常組織=0.77，P癌周組織/癌正常組織>0.05

2.2 兩組患者手術前后TB、CB和總膽汁酸變化

兩組術后TB、CB和總膽汁酸含量較術前顯著下降，且高侵襲組手術前后TB、CB和總膽汁酸含量均顯著高于低侵襲組，差異具有統計學意義（P<0.05）。見表3。

2.3 FXR mRNA表達量與術前TB、CB和總膽汁酸的相關性分析

FXR mRNA表達量與術前TB、CB和總膽汁酸呈顯著正相關，相關系數分別為0.455，0357和0.348。見表4。

3 討論

肝臟作為人體重要解毒器官，參與機體各種解毒過程，而各種代謝的毒性物質往往對肝細胞具有細胞毒性，但肝臟仍能保持較好機能，提示肝臟具有再生潛能[7，8]，Kim I等[9]研究發現，肝臟在病理狀態下，會激活靜息態肝細胞恢復再生能力，修復受損肝組織，促進肝功能恢復。膽汁淤積所致的膽汁酸代謝異常是引起肝損傷，導致肝癌的重要原因之一，而FXR在膽汁酸代謝過程中發揮重要作用[10]，Calkin等[11]研究發現，FXR在修復肝細胞損傷和對抗肝細胞凋亡上具有重要作用。本研究針對我院46例接受肝癌根治性切除術患者，取其切除組織進行研究，發現FXR基因在高侵襲性肝組織中表達量顯著高于低侵襲性組織，推測FXR調控的促進肝再生作用可能參與抵抗肝惡性腫瘤轉移復發過程。

膽汁酸被認為是胃腸道致癌因子，許多專家在小鼠模型中研究發現，攜帶乙肝病毒的小鼠，膽汁酸可誘發其發生肝惡性腫瘤[12]。膽汁酸主要由肝臟分泌至膽汁，其代謝與肝臟顯著相關，肝臟對血液中的膽汁酸親和力強，幾乎可將其完全吸收，當肝功能處于損傷狀態時，患者循環血腫可檢測到膽汁酸含量，故膽汁酸是反映肝臟損傷的重要指標[13，14]。本研究中，患者術前總膽汁酸含量上升，提示肝功能發生損傷，術后膽汁酸含量下降，說明肝功能損傷狀況得到改善。此外，所有患者術前總膽紅素（TB）、結合膽紅素（CB）顯著高出正常水平，而經過手術切除治療后，患者TB、CB含量顯著下降，說明經過手術治療，患者體內膽汁淤積癥狀得到顯著改善[12]。肝細胞不斷參與膽紅素代謝過程，保證膽紅素不斷清除，避免膽汁酸淤積，而當肝臟發生惡性腫瘤時，膽紅素代謝平衡遭到破壞，患者TB、CB和總膽汁酸含量顯著上升，而通過手術切除后，腫瘤負荷降低，患者體內膽汁淤積情況得到顯著改善，故TB、CB與總膽汁酸含量下降[15]。本研究中，腫瘤高侵襲組總膽汁酸含量顯著高于低侵襲組，說明腫瘤侵襲可能和膽汁酸含量具有一定相關性。核受體法尼醇X受體（FXR）具有調節膽汁酸代謝作用，本研究通過對不同侵襲組FXR的mRNA表達量檢測發現，FXR mRNA在高侵襲組高表達，而在低侵襲組表達量則相對較低，提示FXR可能通過參與調節膽汁酸代謝參與腫瘤侵襲過程。FXR在肝臟、腎臟、倡導、腎上腺組織中具有高表達特性[16]，Makishima等[17]研究顯示，膽酸是FXR的體內配體，結合型或者非結合型的膽汁酸均可激活FXR。FXR在高侵襲組織中高表達，究其原因，可能是腫瘤侵襲性強的組織快速增長，擾亂膽汁酸代謝平衡，膽汁酸淤積激活了FXR基因，FXR通過調節下游信號通路加強膽汁酸代謝，使肝臟免受侵襲，而此過程同時激活FXR調節肝細胞修復過程，抵抗癌細胞轉移和侵襲[18]。此外，通過對FXR mRNA表達與TB、CB、膽汁酸相關性檢驗發現，FXR mRNA表達與術前TB、CB、膽汁酸存在顯著正相關，再次證明FXR可能參與抵抗肝惡性腫瘤復發轉移的推測。Fan等[19]研究顯示，基因敲除FXR基因的小鼠注射致癌物后13～15個月便誘發肝惡性腫瘤，并且體內膽汁酸代謝相關蛋白表達出現異常，而對照野生型小鼠則沒有發生此種情況。對敲除FXR基因的小鼠研究發現，小鼠肝內不僅誘發惡性腫瘤，肝細胞和組織也發現明顯凋亡和壞死現象[20]。許多國內外專家均證實，FXF在抑制肝癌細胞增殖和腫瘤轉移復發過程發揮重要作用，揭示FXF可通過反饋調節Ras/Erk和抑制p16/INK4a信號通路參與抗腫瘤過程[15]。此外，FXF具有促進肝細胞再生的功能，Huang等[4]在動物模型中研究顯示，給予0.2%膽酸食物的動物組肝再生程度顯著高于抑制膽汁酸分泌的動物組，而對FXF基因敲除的動物無論添加或抑制膽酸與否，均不會刺激感組織再生，說明FXF可能參與組織再生，FXR修復肝功能損傷功能一旦缺失，則會引發肝細胞功能異常，導致肝細胞損傷甚至凋亡。目前有關FXF在肝癌方面的臨床研究鮮有報道，本研究雖對FXF與肝惡性腫瘤轉移復發的關系做出說明，但研究結果屬于間接推測，還需更進一步驗證。

綜上所述，肝惡性腫瘤復發轉移侵襲性高時，會促進膽汁酸分泌，加劇肝內膽汁淤滯，從而上調FXR mRNA表達量，FXR可能參與抗肝惡性腫瘤復發轉移過程，具體還有待進一步研究證實。

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（收稿日期：2016-11-07）