群體感應(yīng)AHLs對(duì)溫和氣單胞菌體外致腐因子分泌的影響

李婷婷，崔方超，馬艷，勵(lì)建榮*

1(大連民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連，116600) 2(渤海大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州，121013)

群體感應(yīng)AHLs對(duì)溫和氣單胞菌體外致腐因子分泌的影響

李婷婷1，崔方超2，馬艷2，勵(lì)建榮2*

1(大連民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連，116600) 2(渤海大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州，121013)

以大菱鲆腐敗菌溫和氣單胞菌(Aeromonassobria，AS7)為研究對(duì)象，研究了不同處理方式(營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)、共生培養(yǎng)和添加不同種類的AHLs)對(duì)溫和氣單胞菌的致腐因子(嗜鐵素、胞外蛋白酶、生物被膜)產(chǎn)生情況的影響，結(jié)果表明，菌株AS7嗜鐵素的分泌受到培養(yǎng)基質(zhì)的影響，在脫脂牛奶等天然基質(zhì)中可以大量分泌嗜鐵素，而市售的合成培養(yǎng)基中不能分泌嗜鐵素；AHLs的添加對(duì)嗜鐵素的產(chǎn)生量有影響，其中，C8-HSL影響顯著，隨添加的增加，嗜鐵素分泌量呈現(xiàn)正相關(guān)(P<0.05)，而C6-HSL影響不顯著(P>0.05)；共生條件下，溫和氣單胞菌對(duì)熒光假單胞菌和腐敗希瓦氏菌嗜鐵素的分泌有明顯促進(jìn)作用；AHLs的添加可以促進(jìn)溫和氣單胞菌胞外蛋白酶和生物被膜的產(chǎn)量，且呈現(xiàn)正相關(guān)(P<0.05)，說(shuō)明AHLs對(duì)溫和氣單胞菌產(chǎn)生胞外蛋白酶、嗜鐵素和生物被膜具有調(diào)控作用。

溫和氣單胞菌；嗜鐵素；胞外蛋白酶；生物被膜；群體感應(yīng)

引起水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)的主要原因包括酶、微生物及脂肪氧化等作用，新鮮水產(chǎn)品富含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和水分，肌肉組織脆弱，可溶性蛋白質(zhì)和游離氨基酸含量高，pH值接近中性，研究表明約30%的捕獲魚(yú)類是由于微生物單獨(dú)因素導(dǎo)致?lián)p失的[1]。腐敗菌通過(guò)分泌大量的胞外蛋白酶(蛋白水解酶、脂肪水解酶等)將組織結(jié)構(gòu)中蛋白質(zhì)、脂肪等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分解成小分子的醛類、酮類、胺類等，導(dǎo)致魚(yú)類質(zhì)地、風(fēng)味和氣味改變，同時(shí)還分泌胞外多糖等其他代謝產(chǎn)物在魚(yú)肉表面形成黏液或產(chǎn)生有色物質(zhì)，最終導(dǎo)致魚(yú)體腐敗[2]。

AHLs信號(hào)分子作為大多數(shù)革蘭氏陰性菌信息交流的媒介調(diào)控著細(xì)菌某些特定表型的表達(dá)，如生物被膜的形成、嗜鐵素的分泌、胞外蛋白酶的合成及分泌、芽孢的產(chǎn)生、細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性等。WHAN[3]等研究發(fā)現(xiàn)，巴氏消毒奶腐敗變質(zhì)是由假單胞菌的生長(zhǎng)引起的，假單胞菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)可以調(diào)控蛋白水解酶的活性，從而導(dǎo)致了巴氏消毒奶的腐敗變質(zhì)。綦國(guó)紅[4]等在魚(yú)源假單胞菌產(chǎn)生的AHLs信號(hào)分子對(duì)腐敗特性的影響研究中發(fā)現(xiàn)，其細(xì)菌腐敗特性的表達(dá)是通過(guò)群體感應(yīng)現(xiàn)象來(lái)調(diào)控的，AiiA蛋白水解酶對(duì)假單胞菌的AHLs分子進(jìn)行降解可使其腐敗特性表達(dá)的水平下降，從而說(shuō)明水產(chǎn)品的腐敗與AHLs是密切相關(guān)的。CHRISTENSEN[5]等研究發(fā)現(xiàn)，群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控導(dǎo)致冷藏鮭魚(yú)腐敗變質(zhì)的變形斑沙雷菌(Serratiaproteamaculans)B5a 蛋白水解酶的活性。BAGGE-RAVN[6]等、Gubj?rnsdóttir[7]等在魚(yú)制品加工廠及對(duì)蝦生長(zhǎng)環(huán)境中發(fā)現(xiàn)了假單胞菌(Pseudomonasspp.)信號(hào)分子能夠調(diào)控生物被膜的產(chǎn)生。STINTZI[8]等報(bào)道了銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)通過(guò)群體感應(yīng)信號(hào)分子調(diào)控嗜鐵素的分泌。因此，腐敗菌可通過(guò)AHLs介導(dǎo)的QS體系調(diào)控細(xì)菌特定腐敗基因的表達(dá)，從而在食品的腐敗過(guò)程中發(fā)揮作用。

大菱鲆低溫冷藏貨架期終點(diǎn)優(yōu)勢(shì)腐敗菌是腐敗希瓦氏菌和假單胞菌，同時(shí)，不管在腐敗中期還是貨架期終點(diǎn)都有一定比例的氣單胞菌存在，且氣單胞菌屬具有很強(qiáng)的信號(hào)分子分泌能力。所以本實(shí)驗(yàn)利用產(chǎn)AHLs的腐敗菌(溫和氣單胞菌)，通過(guò)添加不同的外源信號(hào)分子標(biāo)準(zhǔn)品(C6-HSL、C8-HSL)和利用天然(牛奶)與人工合成(合成培養(yǎng)基)的培養(yǎng)基質(zhì)研究溫和氣單胞菌群體感應(yīng)系統(tǒng)對(duì)其生物被膜、胞外蛋白酶和嗜鐵素產(chǎn)生的影響，從而確定大菱鲆4 ℃冷藏過(guò)程中QS信號(hào)分子與腐敗菌致腐因子之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料、菌株和培養(yǎng)條件

溫和氣單胞菌AS7、熒光假單胞菌PF14(Pseudomonasfluorescens, PF14)和腐敗希瓦氏菌SP25(Shewanellaputrefaciens, SP25)，從市售大菱鲆中分離，本實(shí)驗(yàn)室保存。溫和氣單胞菌用TSB液體培養(yǎng)基活化，其他菌株均在28 ℃、LB 液體培養(yǎng)基活化，搖床培養(yǎng)，連續(xù)活化兩代。

1.2 儀器與設(shè)備

信號(hào)分子標(biāo)準(zhǔn)品C6-HSL、C8-HSL，購(gòu)于Sigma 公司；鉻天青S (Chrome azurol Sulphonate)、十六烷基三甲基溴化銨(Hexadecyltrimethylammonium bromide HDTMA)、PIPEs，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；瓊脂粉、TSB、LB培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂，北京陸橋生物技術(shù)有限公司；酸水解酪蛋白溶液，上海滬峰化工有限公司；脫脂奶粉，購(gòu)自生工生物工程(上海)有限公司，其他常規(guī)試劑均為分析純。

HZQ-X300C型恒溫振蕩器，BPS-100CA恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；MS105UD電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多有限公司；Purifier Logic生物安全柜，美國(guó)LABCONCO公司；MLS-3020高壓蒸汽滅菌，日本三洋公司；Imark酶標(biāo)儀，美國(guó)BIO-RAD；Biofuge Stratos冷凍高速離心機(jī)，美國(guó)THERMO公司；UV-2700紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 嗜鐵素檢測(cè)

利用CASAD嗜鐵素平板法可檢測(cè)總的嗜鐵素，不受嗜鐵素形態(tài)的限制，根據(jù)文獻(xiàn)[9]，制作CASAD嗜鐵素檢測(cè)平板，制作過(guò)程如下:

1)溶液 A：將 0.06 g的 CAS溶于50 mL 去離子水中，再加入10 mL 1 mmol/L 的FeCl3溶液(含有10 mmol/L 的 HCl)；

2)溶液 B：將0.07 g的 HDTMA溶于 40 mL去離子水中；

3)溶液 C：將A溶液沿著燒杯的壁緩緩加入到B溶液中，輕輕晃動(dòng)，使得溶液A與溶液B混合均勻，即得到溶液 C：CAS藍(lán)色檢測(cè)液。121 ℃，15 min滅菌。

先配制好1 mmol/L 的CaCl2溶液、1 mmol/L的MgSO4·7H2O溶液、10%的酸水解酪蛋白溶液(121 ℃，15 min 單獨(dú)滅菌)；再分別取 0.2 mL 的CaCl2溶液、0.2 mL 的MgSO4·7H2O 溶液、6 mL的 10%的酸水解酪蛋白溶液，加入生物緩沖液 Pipes(sigma)，調(diào)至pH6.8～7.0。去離子水定容到 100 mL。加入 2 g 瓊脂粉，121 ℃，15 min 滅菌。當(dāng)以上的固體培養(yǎng)基滅菌后，溫度降低到 60 ℃時(shí)，以 5 mL CAS 藍(lán)色檢測(cè)液每100 mL CAS培養(yǎng)基的量沿著三角瓶壁加入，混合均勻。注意不要產(chǎn)生氣泡，影響平板檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。然后按照每皿15 mL傾注于培養(yǎng)皿(直徑 90 mm)中。每孔加入菌液200 μL，空白培養(yǎng)基為陰性對(duì)照，每組3個(gè)平行，培養(yǎng)24 h。

1.3.2 蛋白酶活性檢測(cè)

牛奶平板制作參考VIJAYARAGHAVAN[10]的方法：在普通肉湯蛋白胨固體培養(yǎng)基中添加終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的牛奶。15%的脫脂乳粉用水溶解后應(yīng)單獨(dú)滅菌(115 ℃，0.06 MPa，30 min)，鋪平板前再與營(yíng)養(yǎng)瓊脂混合。10 mL 15%脫脂乳粉(單獨(dú)滅菌)，加到90 mL的營(yíng)養(yǎng)瓊脂中，混勻，倒入底層鋪有瓊脂的平板中，打孔器打孔后加入無(wú)菌上清液150 μL,每組3次平行，培養(yǎng)24 h。無(wú)菌上清液制作方法為：將AS7菌株接種至不同培養(yǎng)基中，然后于30 ℃，180 r/min培養(yǎng)24 h后，將培養(yǎng)好的菌液在10 000 r/min、離心15 min，棄菌體，留上清液，上清液加入培養(yǎng)基之前用0.22 μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾除菌。

1.3.3 生物被膜能力測(cè)定

1.3.3.1 酶標(biāo)儀法定量生物被膜

[11]的方法，將過(guò)夜活化的菌懸液與培養(yǎng)基按1∶100體積混勻后，加入到無(wú)菌的標(biāo)準(zhǔn)96孔板中，每組4平行，以無(wú)菌的培養(yǎng)基為空白對(duì)照，在28 ℃下靜置培養(yǎng)。每次取出測(cè)定時(shí)，先棄去培養(yǎng)液，用無(wú)菌蒸餾水250 μL/孔清洗3 次，60 ℃或無(wú)菌風(fēng)干燥固定30 min，隨后用0.1%結(jié)晶紫溶液200 μL/孔染色30 min后棄去染液，用無(wú)菌蒸餾水250 μL/孔清洗3 次，60 ℃干燥后，于200 μL/孔的95%乙醇溶解5 min，酶標(biāo)儀法測(cè)定OD595值，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)，分別按不同時(shí)間(12、24、36、48、96 h)培養(yǎng)。

1.3.3.2 掃描電鏡觀察生物被膜

從培養(yǎng)皿中取出生物被膜載體，用無(wú)菌水沖洗干凈后，無(wú)菌風(fēng)吹干，將載體放入4 ℃預(yù)冷的2.5%戊二醛中浸泡4 h，取出后依次在50%、70%、80%、90%和100%的乙醇中浸泡30 min，再經(jīng)醋酸異戊酯置換2次，自然干燥后噴金處理，用掃描電鏡鏡檢[12]。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理和分析

采用SPSS 13.0 進(jìn)行重復(fù)測(cè)量方差分析，Origin 8.0繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜鐵素分析

嗜鐵素(Siderophore)，又名鐵載體蛋白，是一類由微生物在低鐵條件下合成的相對(duì)分子質(zhì)量小的、能特異地螯合Fe3+的一種螯合因子[13]，嗜鐵素主要是通過(guò)對(duì)鐵離子的競(jìng)爭(zhēng)影響其他細(xì)菌的生長(zhǎng)。菌株產(chǎn)生的嗜鐵素絡(luò)合環(huán)境中鐵離子，使其他微生物得不到足夠的鐵營(yíng)養(yǎng)，生長(zhǎng)發(fā)育受到抑制，從而使菌株能夠維持自己的菌體密度。利用CASAD檢測(cè)平板法，培養(yǎng)基中因含有CAS、十六烷基三甲銨(HDTMA)及Fe3+的三元復(fù)合物而呈現(xiàn)藍(lán)色。嗜鐵素會(huì)奪取藍(lán)色平板中的鐵離子，形成橙色暈圈。

不同培養(yǎng)方式處理的菌液在CAS檢測(cè)平板生長(zhǎng)情況如圖1所示，各個(gè)受試菌株(AS7、PF14和SP25)在市售的合成培養(yǎng)基(LB、TSB)中幾乎不能產(chǎn)生嗜鐵素，而在脫脂牛奶等天然基質(zhì)中可以明顯檢測(cè)到橙色圈，可能的原因是合成培養(yǎng)基中缺少合成嗜鐵素所必須的微量元素，GRAM[14]等研究發(fā)現(xiàn)，希瓦氏菌(Shewanellaputrefuciens)嗜鐵素的分泌受到培養(yǎng)基成分的影響，只有在魚(yú)的提取物中培養(yǎng)時(shí)才能分泌嗜鐵素，在合成的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)不分泌嗜鐵素。綦國(guó)紅[4]等研究發(fā)現(xiàn)食源性假單胞菌在牛奶基質(zhì)中培養(yǎng)時(shí)能夠大量產(chǎn)生嗜鐵素，而在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)未檢測(cè)到嗜鐵素。這與我們的研究結(jié)果相一致。

圖1 不同處理下AS7嗜鐵素的分泌量Fig.1 The siderophore secretion of strain AS7 under different processing

在脫脂牛奶培養(yǎng)基中共生情況下嗜鐵素的分泌情況見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，溫和氣單胞菌對(duì)熒光假單胞菌和腐敗希瓦氏菌的嗜鐵素的分泌具有促進(jìn)作用，對(duì)熒光假單胞菌的促進(jìn)作用尤為顯著，可能是因?yàn)樵诠采囵B(yǎng)的過(guò)程中，溫和氣單胞菌分泌大量的信號(hào)分子到培養(yǎng)環(huán)境中，熒光假單胞菌和腐敗希瓦氏菌具有LuxR型受體蛋白，可以結(jié)合并利用其信號(hào)分子調(diào)控自身嗜鐵素的分泌，我們前期研究結(jié)果顯示，熒光假單胞菌嗜鐵素的分泌受到群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控[15]。

為進(jìn)一步研究群體感應(yīng)與溫和氣單胞菌的關(guān)系，添加了不同濃度的C6-HSL和C8-HSL標(biāo)準(zhǔn)品，結(jié)果見(jiàn)圖2。添加C6-HSL對(duì)菌株AS7嗜鐵素的分泌并沒(méi)有促進(jìn)作用，而C8-HSL對(duì)菌株AS7嗜鐵素的分泌有顯著影響，隨著添加濃度升高，暈圈直徑明顯變化，呈現(xiàn)正相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)前期研究發(fā)現(xiàn)C8-HSL為該菌主要信號(hào)分子，溫和氣單胞菌通過(guò)分泌C8-HSL來(lái)調(diào)控嗜鐵素的分泌，STINTZI[8]等報(bào)道了銅綠假單胞菌通過(guò)群體感應(yīng)調(diào)控嗜鐵素的產(chǎn)生量。

1-AS7+TSB；2-AS7+牛奶；3-AS7+SP25；4-AS7+PF14；5-PF14+LB；6-PF14+牛奶；7-SP25+LB；8-SP25+牛奶；9-AS7+50 μL C6-HSL；10-AS7+25 μL C6-HSL；11-AS7+75 μL C6-HSL；12-AS7+100 μL C6-HSL；13-AS7+50 μL C8-HSL；14-AS7+25 μL C8-HSL；15-AS7+75 μL C8-HSL；16-AS7+100 μL C8-HSL圖2 不同處理下AS7嗜鐵素的分泌量Fig.2 The siderophore secretion of strain AS7 under different processing

2.2 蛋白酶分析

水產(chǎn)品屬于高蛋白類食品，其蛋白質(zhì)、游離氨基酸的含量較高，因此，只有蛋白水解酶豐富的腐敗微生物才能在其中大量繁殖，通過(guò)分泌大量的蛋白水解酶水解其中的蛋白質(zhì)，導(dǎo)致水產(chǎn)品失去原有的風(fēng)味和氣味，最終腐敗變性，甚至產(chǎn)生有毒有害物質(zhì)[2]。綦國(guó)紅[4]利用aiiA水解酶對(duì)食源性假單胞菌產(chǎn)生的AHLs分子進(jìn)行降解時(shí)發(fā)現(xiàn)，其蛋白酶活性減弱，表明該菌胞外蛋白酶的產(chǎn)生受群體感應(yīng)調(diào)控。HeNTZER[16]等研究發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌胞外蛋白酶的分泌受到群體感應(yīng)調(diào)控，通過(guò)添加C-30和C-56的群體感應(yīng)抑制劑發(fā)現(xiàn)該菌胞外蛋白酶分泌量明顯降低。

因此，為了確定AHLs是否也影響溫和氣單胞菌胞外蛋白酶的分泌，通過(guò)添加外源信號(hào)分子標(biāo)準(zhǔn)品并利用脫脂牛奶平板法檢測(cè)來(lái)初步評(píng)價(jià)其胞外蛋白酶分泌量與AHLs的關(guān)系，為進(jìn)一步闡釋群體感應(yīng)與腐敗菌致腐能力提供依據(jù)。結(jié)果如圖3和圖4所示，溫和氣單胞菌能夠分泌胞外蛋白酶，且隨著C8-HSL信號(hào)分子標(biāo)準(zhǔn)品添加量的增加呈現(xiàn)正相關(guān)，蛋白水解圈有明顯增加，說(shuō)明AHLs可以促進(jìn)溫和氣單胞菌胞外蛋白酶的分泌。

圖3 不同處理下AS7胞外蛋白酶的分泌量Fig.3 The extracellular protease of strain AS7 under different processing

1-AS7 ；2-AS7+25μL C8-HSL ；3-AS7+50μL C8-HSL；4-AS7+75μL C8-HSL；5-AS7+100μL C8-HSL圖4 不同處理下AS7胞外蛋白酶的分泌量Fig.4 The extracellular protease of strain AS7 under different processing

2.3 生物被膜分析

2.3.1 AHLs對(duì)溫和氣單胞菌生物被膜產(chǎn)生量的影響

生物被膜是微生物為適應(yīng)脅迫環(huán)境、形成有利于生存的特殊生長(zhǎng)狀態(tài)。是由自身分泌胞外黏質(zhì)物(如多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂質(zhì)蛋白等)包裹的，具有高度組織化的多細(xì)胞群體結(jié)構(gòu)[17]。大量研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)可以調(diào)控其生物膜的形成[18]，KJELLEBERG[19]等表明AHLs 調(diào)控細(xì)菌黏附、游動(dòng)、生物被膜的形成。FAZLI[20]等發(fā)現(xiàn)群體感應(yīng)系統(tǒng)可以調(diào)控洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderiacepacia)生物被膜的形成；LEE[21]等研究霍氏弧菌的生物被膜形成時(shí)也發(fā)現(xiàn)相似結(jié)論。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)添加外源信號(hào)分子標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)溫和氣單胞菌生物被膜與群體感應(yīng)的關(guān)系進(jìn)行了研究。結(jié)果如圖5所示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，生物被膜形成量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，0～24 h生物被膜產(chǎn)生量非常少，細(xì)菌以浮游態(tài)存在于培養(yǎng)基中，24～36 h是形成期，36 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，96 h后開(kāi)始衰老，但生物被膜衰老的比較慢，基本維持不變，細(xì)菌的黏附是其形成生物被膜的前提條件。一旦細(xì)菌黏附到接觸表面，黏附的細(xì)菌便會(huì)汲取周圍的營(yíng)養(yǎng)進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，進(jìn)而形成生物被膜。在一定范圍，較高的菌體濃度會(huì)促進(jìn)細(xì)菌在接觸面的黏附，而較多黏附的細(xì)菌會(huì)促進(jìn)生物被膜的形成[22]。添加外源信號(hào)分子標(biāo)準(zhǔn)品，生物被膜的產(chǎn)生量明顯增加，且隨著添加量的增大呈現(xiàn)正相關(guān)，但在培養(yǎng)后期，高濃度的信號(hào)分子添加量會(huì)使得生物被膜衰老迅速，NILSSON[23]等認(rèn)為由AHLs 介導(dǎo)的細(xì)菌QS 系統(tǒng)在細(xì)菌生物被膜形成、附著、固定過(guò)程起著關(guān)鍵性作用。因此，QS系統(tǒng)對(duì)溫和氣單胞菌生物被膜的形成具有調(diào)控作用。

圖5 不同時(shí)間生物被膜產(chǎn)生量與AHLs關(guān)系Fig.5 The relationship between AHLs and biofilm at different culture time

2.3.2 生物被膜掃描電鏡觀察

如圖6所示，溫和氣單胞菌在不同培養(yǎng)時(shí)間其生物被膜形成過(guò)程，在12 h菌體開(kāi)始聚集黏附，是生物被膜的初始形成階段，12～24 h后菌體黏附逐漸增多，細(xì)菌間開(kāi)始出現(xiàn)粘結(jié)，細(xì)菌鞭毛和菌毛會(huì)分泌大量黏性的胞外多聚糖，并與其他胞外基質(zhì)將細(xì)菌包裹起來(lái)，36 h后細(xì)菌生物被膜基本處于穩(wěn)定狀態(tài)，36～48 h為溫和氣單胞菌生物被膜的成熟穩(wěn)定期；而添加不同濃度的外源信號(hào)分子標(biāo)準(zhǔn)品培養(yǎng)48 h時(shí)，結(jié)果如圖7所示，添加AHLs明顯增加溫和氣單胞菌生物被膜的形成速度和產(chǎn)生量，在添加75 μL的C8-HSL能夠形成致密的生物被膜，溫和氣單胞菌生物被膜的形成與添加AHLs濃度呈現(xiàn)正相關(guān)，說(shuō)明群體感應(yīng)能夠調(diào)控溫和氣單胞菌生物被膜的形成。ZHANG[24]等通過(guò)添加玫瑰花茶多酚提取物為抑制劑，抑制了銅綠假單胞菌群體感應(yīng)，從而抑制其生物被膜的形成。

圖6 不同培養(yǎng)時(shí)間下AS7生物被膜形態(tài) (×10.0 K)Fig.6 Biofilm morphology of AS7 at different culture time (×10.0K)

圖7 不同濃度AHLs對(duì)生物被膜的影響 (×10.0 K)Fig.7 Influence of biofilm by the AHLs concentration (×10.0K)

3 結(jié)論

溫和氣單胞菌是水產(chǎn)品中常見(jiàn)的一種腐敗菌，通過(guò)研究營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)、共生培養(yǎng)和添加不同種類AHLs對(duì)其體外致腐因子(嗜鐵素、胞外蛋白酶及生物被膜)的影響可知，其嗜鐵素的分泌受到培養(yǎng)基質(zhì)的影響，在脫脂牛奶等天然基質(zhì)中可以大量分泌嗜鐵素，在市售的合成培養(yǎng)基中不能分泌嗜鐵素，其原因可能是缺乏合成必要的微量元素。共生條件下，溫和氣單胞菌對(duì)熒光假單胞菌和腐敗希瓦氏菌嗜鐵素的分泌有明顯促進(jìn)作用，溫和氣單胞菌信號(hào)分子分泌量大，分泌到共生環(huán)境中被其他菌株所利用，調(diào)控特定生物表現(xiàn)型。AHLs的添加對(duì)嗜鐵素的產(chǎn)生量有影響，其中，C8-HSL影響顯著，隨添加的增加，嗜鐵素分泌量呈現(xiàn)正相關(guān)，而C6-HSL影響不顯著。同時(shí)，AHLs的添加也可以促進(jìn)溫和氣單胞菌胞外蛋白酶和生物被膜的產(chǎn)量，且呈現(xiàn)正相關(guān)，說(shuō)明AHLs對(duì)溫和氣單胞菌產(chǎn)生胞外蛋白酶和生物被膜具有調(diào)控作用。掃描電鏡觀察生物被膜組織結(jié)構(gòu)，也與該實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。

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Influence of quorum sensing AHLs on spoilage factor secretion ofAeromonassobria

LI Ting-ting1, CUI Fang-chao2, MA Yan2, LI Jian-rong2*

1 (College of Life Science, Dalian Minzu University, Dalian 116600, China) 2 (College of Food Science and Technology, Bohai University,National & Local Joint Engineering Research Center of Storage, Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products, Dalian 121013, China)

AeromonassobriaAS7 separated from spoilage turbot were used as test strain. The relationship between different treatment (the nutrition of substrate, symbiotic cultivation and adding different kind of AHLs) and the spoilage factors (siderophore, protase and biofilm) were further studied. The results showed that the secretion of siderophore was affected by medium quality, that could be secret at natural substrate such as skim milk, while could not be produced at synthetic medium. Addition of AHLs had a significant influence on the production of siderophore, wherein C8-HSL was affected significantly and the production of siderophore presented positive correlation with the increase AHLs (P<0.05), while effect on C6-HSL was not significant (P>0.05). The production of siderophore of Pseudomonas fluorescens and Shewanella putrefaciens was obvious promoted when symbiotic cultivation with AS7. Adding AHLs could also promote the production of protase and biofilm, and present the positive correlation (P<0.05), which demonstrated that the AHLs could regulate the production of extracellular protease, siderophore and biofilm in AS7.

Aeromonassobria; siderophore; protase; biofilm; quorum sensing

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201703010

博士(勵(lì)建榮教授為通訊作者,E-mail：lijr6491@163.com)。

國(guó)家自然科學(xué)基金(31301572，31471639)；中國(guó)博士后科學(xué)基金(2014M552302)

2016-09-18，改回日期：2016-11-05